曲霉型水豆豉的制造能够溯源至战国时期，在我国具有悠久的历史。传统式曲霉型水豆豉选用当然注射酒曲制作，曲醅加上辅材后熟而成，具备营养丰富、口味与众不同的特征及养生作用。米曲霉做为曲霉型水豆豉发醇的优越性微生物菌种，其酶系丰富多彩，可在水豆豉酒曲制作环节累积多种多样抗氧化物，在其中的胰蛋白酶系（酸碱性、中性化、偏碱）至关重要，对水豆豉的质量具有关键性功效。而在水豆豉酒曲制作全过程中，米曲霉关键产中性蛋白酶，其活力的多少影响了水豆豉发醇完善的期限和品质，此酶可将大豆蛋白粉溶解为活性多肽、分散碳水化合物等，对水豆豉的营养成分及口味产生具有很大功效。

在工业生产的情况下，选用非纯种发醇对在我国水豆豉企业标准化生产制造具备关键实际意义。而良好的菌苗除开产胰蛋白酶等酶系工作能力强，还应当具有生长发育速度快、产胞子工作能力强等特性，产胞子工作能力强的菌苗更易于变成发醇全过程中的优点菌苗，抑止其他菌苗的成长和繁育，降低霉菌环境污染，减少发醇周期时间，提升生产率。但纯天然菌种产酶工作能力较弱，无法融入工业生产，因而科研工作者实现了大批量的菌苗改进工作中。夏杨复兴根据对米曲霉中性蛋白酶I遗传基因开展定点突变，对搭建好的毕赤酵母Gsll5基因工程技术菌开展工业甲醇诱发，发觉提升糖基化结构域后的基因突变酶魅力较野生型提升了11.5％

殊不知基因工程技术菌种在具体的制造运用遭受较大的限定，现阶段在米曲霉的繁育层面依旧选用的是传统的物理学化学诱变，而清华产品研发的自然压室内温度等离子技术诱变技术性做为一种新式的诱变技术性，对比于传统式的诱变方式，其具备遗传基因损害抗压强度高、基因突变覆盖面广、安全性方便的优点，明显提高了菌种的突变率，近些年广泛运用于微生物菌种繁育行业。该工艺的诱变基本原理根据大气压力频射电弧放电形成的等离子技术（ARTP），等离子技术形成的很多活力颗粒与微生物菌种体细胞及周边栽培基质功效，造成很多的臭氧、活力氮氧自由基，并更改细胞质的渗透性，这种活力颗粒和空气氧化氧自由基进到体细胞，与DNA、蛋白等分子伴侣功效导致DNA的同时和间接性损害，造成人体细胞的SOS等多种多样传统和非传统的修补体制，进而造成高效率基因突变。

曲霉型水豆豉对感观质量标准严苛，对其机构形状规定颗粒物详细、疏松成形，因此其生产制造务必由整颗黄豆经蒸制，以后发醇做成。因为材料的形状缺点造成固态发酵全过程中与微生物菌种触碰室内空间比较有限及对流传热不匀称，从而致使了曲霉型水豆豉了曲醅胰蛋白酶魅力较低。因而本论文运用ARTP诱变技术性培育增产中性蛋白酶魅力米曲霉菌种，并且用整颗黄豆制做复筛培养液开展酶活认证，以求提高曲醅的中性蛋白酶魅力，为曲霉型水豆豉非纯种发醇确立一定的理论基础。

一、原材料和方式

1、菌种

米曲霉（Aspergillus oryzae）NCU一110：从日本生抽酿制用菌粉中剥离而成，经擎科生物转录组测序，转录组测序結果在NCBI网址开展BLAST核对后，其开放阅读框与Aspergillus oryzae isolate F8160（Accessionnumber：MN429212.1）达到99.64％，评定为米曲霉，该菌种具备胰蛋白酶系详细，以产中性蛋白酶为主导的特性。现阶段由江西南昌大学中法食品工程核心储藏。

2、实验试剂与仪器设备

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钾、opo结构脂、三氯乙酸、福林酚试剂、色氨酸、稀盐酸（均为分析纯）：天津大茂化学药品厂；TGL一16B型离心机：英国赛默飞世尔科技有限公司；

SP—756P紫外线由此可见光度计：上海市光谱仪器有限责任公司；HWS—250恒温恒湿设备恒温箱：上海市幼芽实验室仪器有限责任公司。

3、培养液

（1）菌种活化及储藏培养液：土豆葡萄糖水琼脂粉培养液（PDA）；

（2）初筛培养液：干酪素4.009，磷酸二氢钾0.369，磷酸氢二钠1.079，氯化镁0.049，氯化钙0.0029，甘露醇0.59，氧化钠0.169，硫酸铝0.0029，胰蛋白胨0.03～0.059，琼脂粉159，纯净水滴定剂为lL，12l℃杀菌30min；

（3）复筛、酒曲制作培养液：选择1509高品质东北地区大豆，清理后用三倍容积的饮用水于35℃泡浸3h，控干后，121℃杀菌30min；

（4）种曲培养液：麦麸、豆柏、水品质占比为：80∶20∶80，500mL三角瓶装量料509，水40mL，当然pH，121℃杀菌30min；

（5）察氏培养液：硝酸钠3.09，磷酸氢二钾1.09，氯化钾0.59，甘露醇0.59，硫酸铝0.019，绵白糖209，纯净水1L，将以上药物按序融解后，添加209琼脂粉加温融化，散装后121℃杀菌30min。

4、 ARTP诱变

（1）米曲霉胞子混液制取

取活性好的米曲霉NCU一110试管婴儿斜坡，用无菌检测盐水清洗即得胞子悬浮液，抽样开展血球计数板记数，将胞子悬浮液稀释液至106CFU/mL，预留。

（2） ARTP诱变标准的明确

选用氮气为工作中汽体，使载片与等离子技术产生器水射流出入口间隔约2mm，输出功率为120W，气总流量10L/min，对10μL胞子悬浮液开展诱变解决，设定诱变時间为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9min。梯度方向稀释液诱变后胞子悬浮液各自为4.0×10⁴CFU/mL、4.0×10³CFU/mL和4.0×10²CFU/mL，各取100μL施胶于初筛细胞培养皿，30℃遮光控温塑造3d，测算死亡率，制作至死趋势图。

死亡率=（对比菌体数一诱变平板电脑菌体数）/对比菌体数×100％

5、增产中性蛋白酶魅力菌种挑选

（1） 初筛方式

挑选最好诱变時间下的胞子混液，适度稀释液（4.0×10²CFU/mL）后施胶于初筛培养液，30℃塑造72h，观查每个培养皿中初筛菌种的全透明圈和菌体尺寸，挑菌菌体比较大而且全透明圈显著的60株米曲霉（序号NCU—A1-A60）单菌体注射于PDA试管婴儿斜坡，于30℃塑造3～5d，待试管婴儿中基因突变米曲霉真菌铺满浅绿色胞子，将60株米曲霉与初始菌种在初筛培养液上开展点种试验，测算K值并取K值比较大的18株基因突变菌种开展下一步复筛试验。

K=全透明圈直徑／菌体直徑，K值意味着了菌种产胰蛋白酶的工作能力，能够用于分辨基因突变株造成胰蛋白酶魅力的尺寸。

（2）浅盘酒曲制作复筛增产中性蛋白酶魅力基因突变株

将K值比较大的18株初筛菌种活性，制取胞子悬浮液并稀释液至107CFU/mL。依据曲霉型水豆豉浅盘酒曲制作加工工艺，依照1.0％的接种量，早期发酵温度操纵在30～34℃，酒曲制作至第一8～24h，黄豆粒表层满布乳白色真菌，开展第一次翻曲；当曲醅发生品绿胞子时，开展第二次翻曲，温控在28～32℃。塑造至72h抽样，选用SB/T 10317—1999中的福林酚测定方法各菌种曲醅中性蛋白酶魅力。

6、基因突变株基因遗传可靠性认证试验

将复筛获得的数株中性蛋白酶魅力明显提升的基因突变株和初始菌种在PDA试管婴儿斜坡上30℃连续传代9次，对以上菌种第一～9代水豆豉曲醅的中性蛋白酶魅力开展测量，检验复筛菌种的基因遗传可靠性。