鲶鱼（Silvercarp，Hypophthalmichthysmolitrix），脊索动物门、硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、鲢属，是广为人知的四大家鱼之一，生产量仅次鲤鱼，2019年年销售额381.0三万t。鲶鱼中包含充足的蛋白质食物和多种多样不饱和脂肪，包含8种必须氨基酸和组氨酸，在其中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的成分做到海水鱼规范；鲶鱼中还包含钾、钠、钙、镁、磷等常量元素及其锌、硒、铁等营养元素。其肉薄刺多，腥味较重，销售市场上主要是以活物的市场销售为主导，一部分鲶鱼被生产成冷冻品鱼肉、饲料产品及虾丸，利用率不高，还导致许多的废弃物，污染环境，資源消耗比较严重，顾客接受度小于其他海产品。根据生产加工成鱼浆产品，可增强其经济价值。

鱼浆产品在冻藏全过程中容易腐坏霉变。其腐坏体制涉及到微生物、有机化学、物理学等转变 ，在其中，微生物菌种是造成腐坏的首要要素，尤其是新颖和冷冻产品，因为未经由高温度解决或其他处理方法消毒杀菌，粘附在食物中的细菌生長繁育，最后造成食品类腐坏霉变。Lücking等对369种腐坏的食品类试品的研究发现，蜡样芽胞链球菌和蕨类芽胞链球菌占主导性，还检验到极少数的海面芽胞八叠革兰阴性杆菌，与此同时证实蕨类芽胞链球菌具备一定的蛋白质核糖核苷酸活力，可以溶解运用蛋白。本精英团队过去的研究发现，蕨类枯草芽孢菌是导致鲶鱼糜产品腐坏的优点腐坏菌之一。1945年，法国Rose等在蕨类芽胞链球菌中发觉碱性蛋白酶，它是一类在偏碱情况下可以水解反应蛋白肽键的抗氧化物。赵巧灵运用差别蛋白组学技术性科学研究蓝鳍金枪鱼在冷冻历程中的质量转变，鱼类机构胰蛋白酶加快肌原纤维构造蛋白溶解全过程，毁坏鱼类组织架构，造成 鱼类质量降低。

本实验中，运用差别蛋白组学技术性科学研究蕨类芽胞链球菌碱性蛋白酶对鲶鱼肌原纤维蛋白质的溶解功效，找寻溶解全过程中的肌原纤维蛋白质差别蛋白质点，并运用GO作用注解及KEEG通道剖析鲶鱼肌原纤维蛋白质微生物菌种溶解的方式，为将来鲶鱼等海产品的微生物菌种腐坏科学研究带来理论来源。

1原材料与方式

1.1原材料与实验试剂

活鲶鱼购于辽宁营口市林南街水产市场，1h内运输至试验室，马上凉水至死。固相pH值梯度方向（immobilizedpHgradient，IPG）预制构件干密封胶条（pH4～7，17cm）、媒介两性关系电解质溶液（pH3～10、pH5～8、pH4～6和pH5～7）、Ｔrisbase、苯甲基磺酰氟（PMSF）、尿素溶液、硫脲、二硫苏糖醇（DＴＴ）、碘乙酰胺、3-[3-（胆氟苯丙基）二甲羟基]丙磺酸内盐（CHAPS）、聚合硫酸铁凝胶电泳（PAGE）所需正丁酸、甲叉双丙烯酰胺、十二甲基硝酸钠（SDS）、矿物质机油、四羟基乙二胺（ＴEMED）、过硫酸铵、甘氨酸均选购自英国BioRad公司；凡士林、溴酚蓝、琼脂糖均为国内分析纯，全部水溶液均以Milli-Q超纯水系统制取的超纯水系统为有机溶剂。

1.2仪器设备与机器设备

5800MALDI-ＴOF/ＴOF质谱仪器，ABSCIEX企业；UＶ-2550型紫外线由此可见光度计，日本安捷伦仪器企业；MILLI-QREFERENC超纯水系统，英国密理博企业；GS-800-ＴM校准型光密度扫描机，英国Bio-Rad公司；DL-1005型超低温冷冻液循环，上海市汉诺仪器设备有限责任公司；PROＴEANIEF等电对焦电泳仪，英国Bio-Rad公司；PROＴEAN83ⅡXL电泳槽，英国Bio-Rad公司；ZD-9556型水准脱色摇床，常州市凯航仪器设备有限责任公司；FE20pH计，梅特勒-托利多仪器设备有限责任公司；SORＶALLStratos冷藏离心机，英国Ｔhermo企业。

1.3实验方式

1.3.1原材料预备处理

1.3.1.1鲶鱼肌原纤维蛋白质获取

参照李学鹏等的方式 ，取鱼类20g并搅碎。添加5倍容积10mmol/L的Ｔris-HCl（pH7.2），快速匀质2min，每过30s，停30s。在5000r/min、4℃标准下离心式15min。取沉积，在沉积中添加3倍大小的ＴrisHCl（含0.6mol/LNaCl，10mmol/LＴris，pH7.2）缓冲溶液，快速匀质，后在4500r/min、4℃标准下离心式15min，双缩脲测定方法其浓度值。取上清液储藏在-80℃冰柜中预留。

1.3.1.2碱性蛋白酶解决

将干酶粉稀释液至0.01g/mL，并取20mL肌原纤维蛋白质水溶液，加上等同于蛋白品质0.1%的偏碱胰蛋白酶酶液，放置磁力搅拌器上，各自在4℃和25℃下反映。碱性蛋白酶解决時间各自为：4℃选择0，1，2h；25℃选择0，0.5，1h。反映完成后马上添加适量50mmol/LPMSF抑止酶活。

1.3.2双向电泳

1.3.2.1等电对焦程序流程

参照Bio-Rad公司双向电泳实际操作技术性指南及本精英团队早期已探究出鲶鱼肌原纤维蛋白质的双重凝胶电泳技术性（twodimensionalgelelectrophoresis，2-DE）开展实验。将少量的已定量分析蛋白水溶液与凝固上样缓冲溶液（含7mol/L尿素溶液、2mol/L硫脲、4%CHAPS、65mmol/LDＴＴ、0.2%媒介两性关系电解质溶液和0.001%溴酚蓝）充足混和，选用17cm，pH4～7的IPG预制构件干密封胶条开展等电对焦，100μg，300μL积极凝固上样，着色方法为硝酸银上色。等电对焦程序流程基本参数如表1所显示。

1.3.2.2密封胶条均衡

等电对焦完毕后，每根密封胶条用6mL密封胶条均衡缓冲溶液Ⅰ〔6mol/L尿素溶液、2%SDS、0.375mol/LＴris-HCl（pH8.8）、20%凡士林和2%DＴＴ〕缓和中液Ⅱ[6mol/L尿素溶液、2%SDS、0.375mol/LＴris-HCl（pH8.8）、20%凡士林和2.5%碘乙酰胺]开展密封胶条均衡，每一次14min。

1.3.2.3第二向SDS-PAGE竖直凝胶电泳

将均衡结束的密封胶条于1×电级缓冲溶液（含3g/LＴrisbase、14.4g/L甘氨酸、1g/LSDS）中洗掉不必要平衡液，各自迁移至提早制完的第二向10%，12%，15%聚正丁酸分离出来胶上方，并添加低溶点琼脂糖上胶液（0.5%低溶点琼脂粉、25mmol/LＴris-base、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS和0.001%溴酚蓝），清除汽泡，待其完全凝结后，迁移至垂直电泳槽中，恒流源开展第二向SDS-PAGE，程序流程见表2。

1.3.2.4银染、凝胶成像及剖析

选用论文参考文献的办法并略微改动。将银染后的疑胶转到GS-800疑胶扫描仪成像仪投影服务平台上。

选用PDQuest8.0二维疑胶图象技术专业分析系统对所述图象开展环境削减、蛋白质点检验和配对等解决，找寻差别蛋白质点。

1.3.3差别蛋白质点的质谱分析评定

1.3.3.1酶解

参照Addis等和Bernevic等的方式 ，从银染的疑胶上获得蛋白点，放进硅化解决过的1.5mL少量离心管架中，用超纯水系统不断浸洗后，对该蛋白质点开展胶内酶切。

1）褪色

在挂有蛋白质点的移液管中，添加50μL褪色液[15mmol/LK3Fe（CN）6溶解50mmol/LNa2S2O3中]，将蛋白质点的深棕色褪色至浅绿色，用超纯水系统浸洗以停止反映，直到蛋白质点变成没有颜色全透明。随后将蛋白质点所依附的正丁酸剁碎，用100mmol/LNH4HCO3浸洗，并且用100%乙腈（色谱纯）褪色至正丁酸疑胶色调泛白，接着将其放置冷藏真空干燥器中开展干冻。

2）酶解

用pH8.0的蛋白酶液（以50mmol/L硝酸钾水溶液为有机溶剂）将干冻的试品于37℃酶解留宿。每一个蛋白质点蛋白酶使用量依据蛋白质点尺寸，每一个蛋白质点约40～100ng蛋白酶。

3）提纯

酶解后的肽段用60μL5%ＴFA和50%乙腈开展提纯，反复2次，每一次15min，合拼提取液并真空泵排干。

4）试品复溶与除盐

选用0.1%ＴFA水溶液将干躁后的试样再度复溶，并且用ZipＴIP移液嘴除盐。将1μL除盐后的试品放置质谱分析试品板上实现当然干躁，开展MALDI-ＴOF/ＴOF剖析，检验标准见表3。