麦子皮肤过敏、乳糜泻、非乳糜泻麦子比较敏感(NCGS)等“麦子有关病症”在世界各国的患病率在持续升高。针对这种病症病人来讲。防止摄取麦子致敏物蛋白质是唯一且合理的方式圈。除研究皮肤过敏体制、找寻医治的切入点外，产品研发低致敏性的麦子食材变成当下急需解决的难题。乳酸菌饮料在进行发酵全过程中根据自己的蛋白质水解系统软件溶解有关蛋白及活性多肽，并根据产酸更改发酵面团的pH值以激话小麦面粉的内源胰蛋白酶.进一步加强蛋白的溶解。在蛋白溶解为活性多肽及碳水化合物时，既更改了面糊口味，也更改了致敏蛋白质的成分。除此之外，乳酸菌饮料新陈代谢造成的抗真菌药化学物质能够增加商品货架期，造成的胞外含糖量能够改进面包的质量。鉴于此，乳酸菌发酵做为一种很有发展前景的发醇方法，非常值得进一步的研究。乳酸菌饮料类型多种多样，现阶段针对其减少麦子蛋白质抗原性的分析多聚集于乳酸菌发醇层面。干酪乳杆菌被证明具备体细胞被膜胰蛋白酶，而这些酶在溶解蛋白的环节中起着很重要的功效。除此之外，很多研究表明生产加工方法危害食材蛋白质的抗原性，现阶段用以减少食材蛋白质抗原性的生产办法具体有热处理(蒸制、烤制等)和非热处理(发醇、酶解、超声波等)。蒸制等热处理方法会变化食材蛋白质的构像构造，进而更改抗原体的构像表位。而抗原体蛋白质线性表位的影响关键产生在发醇和酶解全过程中。Rao等研究发现超低温烤制和清煮可以造成较低致敏性的花生仁。Rui等运用乳酸菌发醇减少了黄豆分离蛋白的抗原性。运用碱性蛋白酶和蛋白酶k持续酶解减少了麦子中致敏谷蛋白成分。本科学研究运用分离出来自发面中的1株干酪乳杆菌发酵面团，科学研究其对麦子致敏物蛋白质成分及抗原性的危害，科学研究生产加工标准与抗原性中间的关联，为开发设计低致敏性麦子产品给予理论来源。

1 原材料与方式

1.1 原材料与实验试剂

革兰氏染色检测试剂盒、病菌组DNA获取检测试剂盒、乳杆菌可选择性琼脂粉、Bradfbrd蛋白质浓度值测定试剂盒、SDS-PAGE分离出来/浓缩胶缓冲溶液、预染蛋白质Maker、SDS-PAGE蛋白质上样缓冲溶液、AP-羊抗兔二抗、BCIP/NBT偏碱磷酸酯酶着色检测试剂盒。北京索莱宝高新科技有限责任公司：EL-TMB着色检测试剂盒，上海市生工生物：实验常用实验试剂均为分析纯级，兔皮肤过敏血清蛋白由试验室自做。

1.2 关键仪器设备

PCR热力循环仪，杭州市晶格常数仪器设备有限责任公司；凝胶成像系统软件，上海市勤翔仪器设备有限责任公司；Mul-tiskanFC酶标仪，上海市赛默飞世尔企业；mini-proteanⅡ疑胶仪，英国伯乐相马企业。

1.3 实验方式

1.3.1 干酪乳杆菌的分离出来评定

称量酸面糊试品5g于无菌检测匀质袋里，添加45mL杀菌后的蛋白胨水(1％蛋白胨，0.43％NaCl，0.72％Na₂HP0₄，0.36％KH₂PH0₄，pH7.0)，搅拌后梯度方向稀释液，取10^-5～10^-7稀释液梯度方向，施胶于乳杆菌可选择性琼脂粉培养液，37℃塑造24h。任意挑菌菌体开展过氧化氢酶和革兰氏染色实验。取双氧水酶呈阴性、革兰氏阳性且镜检查为杆状的菌种开展进一步分子结构评定。

选用病菌组DNA获取检测试剂盒获取所分离出来菌种的DNA，运用病菌通用引物27F(5’-AGCG-GATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTrGTACGA-3’)和1492R(5’-GCAGAGTTCTCGGAGT.CACGAAGAGTlTI’GATCCTGGCTCAG-3’)根据PCR反映对16SrRNA遗传基因开展增加。PCR反映情况为：94℃预转性5min：94℃转性30s。55℃淬火30s，72℃拓宽5min，3五个循环系统：72℃充足拓宽10min。增加物质经琼脂糖电泳电泳原理检验后送于北京市生工生物工程项目有限责任公司转录组测序。所得的编码序列与NCBI百度文库核对后，用MegaX搭建进化树。

1.3.2 菌种生长曲线和菌体数与0D值对应关系的测量

取一支冻存菌苗于MRS液体培养基中，37℃下活性24h。取O.5mL活性菌液于6个各自配有30mLMRS骨头汤的三角瓶中。37℃塑造0，4，8，12，16，20h，在光波长600nm处精确测量各时间段菌液OD值值，制作生长曲线。

取活性菌液用MRS骨头汤稀释液2，2.5，3，4，5，6倍，测量0D600nm值，并梯度方向稀释液，竭尽于MRS琼脂粉中，37℃塑造48h后测算活菌数。

1.3.3 酸面糊的制取

取指数值成长期菌液，6000×g离心式10min，盐水清洗2次，双蒸水重飘浮至50mL，调整OD‰数值0.8。100g小麦面粉与50mL菌悬浮液资金投入压面机。揉面15min，面糊内菌体总数约为108CFU/g。发酵温度30℃，空气湿度80％。发醇24h，按时抽样。

1.3.4 发醇全过程中pH值、可滴定管酸值(TTA)和面团蛋白质成分的测

每过2h抽样，于无菌检测匀质袋里10倍稀释液后混和匀称，测量pH值并且用0.1mol/LNa0H滴定管至pH数值8.3，纪录所耗费Na0H的容积数即，TTA值。

将发酵面团试品干冻后研磨成粉于-20℃储存。蛋白质获取参考Prado等的方式 。具体步骤如下所示：向500mg小麦面粉中添加10mL％s-HCl缓冲溶液(50mm01，L，pH8.8)，于4℃下拌和1h，20000×g，4℃离心式20min，搜集上清液(清蛋白和血蛋白)；沉积用5mL缓冲溶液清洗3次，添加10mL75％酒精，室内温度下拌和1h，离心式20min，搜集上清液(醇溶蛋白质)；选用5mL75％酒精洗涤沉淀3次，添加10mL50mmol/LTris-HCl(pH8.8，1％SDS，0.5％DTT)，4℃拌和2h，离心式20min，搜集上清液(谷蛋白)。选用考马斯亮蓝法测蛋白浓度值。

1.3.5 SDS-PAGE电泳原理及免疫印迹剖析

参考Rao等的方式 ，具体步骤如下所示：制取12％的分离出来胶和5％的浓缩胶，试品溶液稀释为同样浓度值后与5x上样缓冲溶液混和并开水加温5min，气相后开展竖直电泳原理(浓缩胶工作电压80V，分离出来胶工作电压110V)，电泳原理完毕后选用考马斯亮蓝R250上色，褪色后于凝胶成像系统软件照相。

未上色的电泳原理胶迁移至硝酸纤维素膜上(300mA冰浴下转膜90min)，丽春红上色确定转膜取得成功。添加5％脱脂奶，摇床边摇晃封闭式2h；添加稀释液的-抗(抗麦子蛋白质兔血清蛋白)，4℃下孵育留宿；TBST缓冲溶液(0.02mol/LTBS，0.05％Tween-20，pH7.6)洗膜后，添加稀释液的AP-羊抗兔二抗，室内温度下孵育90min；洗膜后。运用BCIP/NBT偏碱磷酸酯酶着色检测试剂盒着色。

1.3.6 不一样发醇方法及热处理方式制作馒头

向100g小麦面粉(乳酸菌饮料菌体数108～109CFU/g)中添加50mL菌悬浮液和0.35g安琪酵母调配面糊后各自发醇。冷藏发酵标准为：4℃发醇3d后于37℃，80％空气湿度发醇60min：一次发醇标准为：37℃，80％空气湿度发醇60min；二次发酵标准为：中种面糊(60g小麦面粉，0.35g酵母菌，30mL菌悬浮液)于37℃发醇4h后添加40g小麦面粉和20mL水再次发醇1h。发醇好的3种面糊用以烘烤(180℃，20min)和煮制(开水煮制20min)。抽样干冻，研磨成粉预留。

1.3.7 蛋白质成分及酶联免疫吸咐实验测

总蛋白获取参考Akagawa等的方式 ，具体步骤如下所示：25mg小麦面粉添加1mL蛋白质萃取液[40mmol/LTris，8mol/L尿素溶液，4％3-[3-(胆氟苯丙基)二甲羟基]丙磺酸内盐(cHAPs)，冰浴下超声波获取30s，6次；4℃下16000×g离心式20min，搜集上清液，考马斯亮蓝法测蛋白量浓度。

选用酶联免疫吸咐实验点评试品抗原性。应用50mmol/L，pH9.6的硫化物缓冲溶液稀释液蛋白质至5μg/mL，按100μL孔添加酶标板，4℃静放留宿；用TBST洗板4次，按150μL/孔添加1％BSA封闭液，37℃温育2h；TBST洗板后按100μL/孔添加应用1％BSA稀释液的抗麦子蛋白质兔血清蛋白封闭液(1:10000)，37℃温育2h，洗板；按100μL/孔添加500倍稀释液的羊抗兔HRP-IgG，37℃温育1h，洗板；应用TMB着色检测试剂盒着色，于光波长450nm处测0D值。

1.4 数据统计分析

实验数据信息用SPSS手机软件解决，图由GraphPadPrism制作。