1前言

绿色植物细菌病虫害是导致农业产品耗损的首要缘由之一，在现实制造中产生了无法估量的财产损失。病菌浸染主茎后，使粮食作物部分或整棵感病，危害植物生长发育，比较严重时导致主茎身亡，造成农业产品生产量减少，质量降低。大部分病菌不但能在植物生长发育历程中危害主茎情况，仍在农业产品的输送全过程中导致商品易腐烂，是导致蔬菜水果运送耗损的首要缘故。除此之外，一部分细菌病菌可以代谢真菌毒素，服用带有真菌毒素的蔬菜水果可以造成畸胎或引起癌病，威协人们身心健康。如多种多样链格孢造成的链格孢内毒素及其多种多样曲霉造成的伏马菌素B。

几丁质，是由N-酰胺基-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）单个根据β-1，4-糖苷键联接的高聚物，也是病源真菌细胞壁的主要成分。在丝状真菌中，几丁质和别的聚糖成分占细胞壁成分的70%之上，在一部分酵母菌中，几丁质成分乃至做到细胞干重的10%～20%。几丁质酶能够根据外切和/或内切圆核糖核苷酸功效将几丁质裂化为GlcNAc或GlcNAc的可溶寡聚体。因而，以几丁质做为分子结构靶点，根据几丁质酶的水解作用来完成植物病害预防是植物病害操纵的重要途径。而害虫防治因素代谢植物细胞裂化酶，裂化病源真菌细胞壁，也变成害虫防治微生物菌种拮抗作用绿色植物病源细菌的具体体制之一。

排风管菌（Bjerkanderaadusta）归属于非褶菌目，多孔结构菌科，排风管菌属。现阶段，针对排风管菌（Bjerkanderaadusta）的分析主要是聚集在环境生态工程行业，但仍不缺排风管菌对绿色植物细菌病虫害整治的分析报导。1982年，Dománski发觉排风管菌可以抑止栎树（Quercusrobur）褐腐病的产生。2011年，Bak等研究发现了排风管菌对欧美国家黑杨（Populuseuramericana）干腐病具备防治工作能力；2015年，汪华等挑选出一株对水稻纹枯病菌或瓜亡革菌（Thanatephoruscucumeris）、大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）、茄科罗尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）等造成的植物病害具备非常好防效的排风管菌M-1；2017年，Zhang等研究发现排风管菌可以合理的抑止西瓜蔓枯病原菌（Didymellabryoniae），并在2018年初次研究了排风管菌对核盘菌的抑制效果以及对油菜菌核病（Sclerotiniasclerotiorum）的防效。但现阶段，依然欠缺排风管菌害虫防治体制科学研究。本科学研究融合抗病性实际效果和RT-qPCR剖析，初次从排风管菌中挑选并复制出一个几丁质酶遗传基因，并根据外源性表述证实了该酶的抗真菌药活力。推断该遗传基因是排风管菌充分发挥生防功效历程中的植物细胞裂化酶遗传基因。

2原材料与方式

2.1原材料

本氏烟（Nicotianabenthamiana）。

排风管菌（Bjerkanderaadusta）菌种BK-1从四川省马尔康市土壤层中得到，储藏于本试验室，ITS系列号为MW182414（NCBI）。链格孢（Alternariaalternata）菌种CD-1，链格孢iPhone专化型（Alternariaalternataf.sp.mali）L-1，细极链格孢（Alternariatenuissima）SCAU-1和灰红提孢（Botrytiscinerea）DY-1均为本试验室储藏菌苗。尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）（BNCCNO.143078），茄链格孢（Alternariasolani）（BNCCNO.337910）购自北纳生物（BeNaCultureCollection，BNCC）。

PCR引物设计见表1及表2。

2.2方式

2.2.1排风管菌抗病性工作能力剖析

将灰红提孢，链格孢和细极链格孢接转到PDA培养液中25℃活性塑造7d，应用外径为5mm的打孔器割除真菌琼脂块做为接种物；排风管菌活性塑造7d后，将5个直经为5mm的排风管菌真菌琼脂块注射至液态的100mLPDB培养液中25℃，180r/min活性塑造7d后应用破碎机粉碎，做成排风管菌真菌悬浮液做为抗菌液（AntiL）预留。

石蜡切片试验：从生长发育30d的香烟主茎上裁取身心健康的香烟叶子水流清洗10min，应用保鲜袋封死叶茎创口处，置放于无菌水淋湿的三层过滤纸上，在主叶柄两边对称性部位各自擦抹50μL无菌水和排风管菌真菌悬浮液后注射病菌真菌琼脂块做为对照实验和对照组，每一组6反复。再将叶子和过滤纸放进顶层张口的塑料盒子中，顶层应用保鲜袋密封维持盒里潮湿。将其放置温室大棚内（23℃，16h阳光照射；18℃，8h黑喑），维持48h（细极链格孢浸染96h）后对香烟叶子开展拍摄纪录。

活体实验：选择身心健康的香烟主茎，将从上至下第4片叶子做为注射目标，接种方法同离体试验。将注射后的主茎置放在密闭式，透光性且潮湿的育苗盆内，温室大棚塑造48h（细极链格孢浸染96h）后照相纪录。

以上试验最少反复2次，并应用ImageJ开展叶子感病总面积统计分析。

2.2.2生物信息学剖析

参照该菌种基因有关信息（NCBIBioProjectID：PRJNA667319），应用SignalPv5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对其几丁质酶遗传基因和β-1，3-甘酶遗传基因开展信号肽预测分析；并在NCBI数据库查询（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对几丁质酶的传统结构域开展核对。

2.2.3僵持塑造及RT-qPCR剖析

将6种病源细菌和排风管菌注射到PDA培养液中，25℃遮光情况下活性塑造5d，应用打孔器取各菌体边沿处直徑为5mm的菌块。各自将排风管菌和一种病菌注射到新的PDA培养液中，各间距平板电脑边沿2cm，并使两菌块维持在同一直徑网上25℃遮光塑造。

应用细菌RNA迅速抽提检测试剂盒（生工），获取僵持塑造研究中注射后第六d互相触碰地区真菌的RNA，应用EasyScript©One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix（全式金）开展反转录获得cDNA.以cDNA为模版，以18SrRNA做为参照遗传基因，应用2×T5FastqPCRMix（SYBRGreenII）检测试剂盒（擎科）对预测分析具备信号肽构造的几丁质酶遗传基因和β-1，3-甘酶遗传基因开展表述量测量。

2.2.4排风管菌几丁质酶遗传基因BaCHIB复制

应用高保真音响酶1-5TM2×Hight-FidelityMasterMix（MCLAB）增加除去信号肽区间的几丁质酶遗传基因BaCHIB-T，并在C端加上6×His蛋白纯化标识。以排风管菌cDNA为原始模版，事后PCR全过程先后应用上一步增加物质为模版，获得目地精彩片段BaCHIB-T，实际引物设计如下所示：①.BaCHIB-Cl-F/R；②.BaCHIB-Cl-F和His1-R；③.BaCHIB-Cl-F和His2-R；④.EcoRⅠ-T-F和NotⅠ-R。

应用约束性内切酶EcoRⅠ和NotI解决媒介pPIC9K.运用同源重组检测试剂盒（诺唯赞）将BaCHIB-T与归一化处理的媒介同源重组获得资产重组媒介pPIC9K-BaCHIB-T（图1），转录组测序恰当的表达载体应用约束性内切酶salⅠ归一化处理，冰醋酸锂转化法转换毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115菌种。

2.2.5重组蛋白的体现和提纯及抗真菌药活力

蛋白质的体现和提纯依照Deng等的办法开展，并做好改善。资产重组媒介的表述菌种经0.5%的工业甲醇诱发5d，同样解决的满载转换菌种用以对照实验。先后应用带有80，100，120，140mmol/L咪唑的聚磷酸盐缓冲溶液（PBS）过柱与柱融合的总体目标蛋白质。目地杂带经SDS-PAGE电泳原理检验。几丁质酶活力测量应用几丁质酶活力诊断试剂盒（索莱宝）。

提纯后的重组蛋白，浓度值调节为200μg/mL开展抗真菌药活力检验。从活性5d的链格孢，茄链格孢和灰红提孢的平板电脑边沿割除二块周长约为5～10mm的方形真菌琼脂块，并将其放置2mL离心管架中。每管添加400μL提纯蛋白质水溶液做为对照组，相等蛋白质过柱液做为对照实验25℃暗塑造48h后，观查真菌生长发育情况。