羟基甲酸乙酯（Ethylcarbamate，EC）是一种在小动物甚至人体内具备潜在性致癌物质的2A类致癌物质，存有于多种多样发酵食品及酒精饮料中，如生抽、乳酪、红酒、米酒等。研究表明，尿素溶液、瓜氨酸、氨甲酰硫酸铵、氰酸和焦炭酸二甲酸是EC产生的磷酸激酶物，在其中酵母和一部分乳酸菌饮料根据精氨酸新陈代谢路径造成的尿素溶液和瓜氨酸是最重要的2种磷酸激酶物。

酒水的瓜氨酸关键自精氨酸脱亚胺酶方式新陈代谢造成，在这里一方式中包含3种重要酶，各自为精氨酸脱亚胺酶（Argininedeimidase，ADＩ，EC3.5.3.6）、鸟氨酸氨甲酰基转移酶（Ornithinetranscarbamoylase，OTC，EC2.1.3.3）和羟基苯甲酸蛋白激酶（Carbamatekinase，CK，EC2.7.2.2）。该方式将精氨酸水解反应，最后转换为鸟氨酸、氨和二氧化碳。

现阶段有关鸟氨酸氨甲酰转移酶的分析较少，关键聚集在人体内，因为是肝部尿素循环的必不可少酶，因而OTC酶的缺少常造成总想睡觉、恶心呕吐、精神实质生长迟缓等病症，与此同时OTC的缺少是否也可做为肝细胞癌的初期检测指标值之一。依据以前的研究发现，OTC与羟基甲酸乙酯的产生呈负关联性，即OTC的表述对EC的产生有抑制效果，殊不知OTC与EC的立即关联性末见科学研究报导。

短乳酸杆菌是一类革兰氏阳性兼性厌氧菌，在含蛋白质的小动物、绿色植物发醇商品及其温血爬行动物的消化道中十分普遍，做为一般觉得安全性（Generallyrecognizedassafe，GRAS）的食品级不锈钢微生物菌种，在食品类、工业生产、农业及制药等行业中亦有着关键的使用使用价值。发掘益天性乳酸菌饮料源的抗氧化物是现在我们的侧重点之一。

本分析以短乳酸杆菌中的鸟氨酸氨甲酰基转移酶为目标，根据分子克隆表述方式和Ni-NTA提纯方式，得到很多纯度高的OTC酶，在米酒发醇的不一样环节可以直接加入到酒质中，科学研究其与EC中间的相互影响，为发掘其潜在性的工业生产使用使用价值打下基础。

1 原材料与方式

1.1 原材料与实验试剂

短乳酸杆菌（Lactobacillusbrevis）和质粒pET28a由本试验室储存，大肠埃希菌（Escherichiacoli）BL21（DE3），全试金企业。病菌基因获取检测试剂盒、质粒DNA获取检测试剂盒、PCR物质回收利用检测试剂盒、琼脂糖电泳回收利用检测试剂盒、Ni-NTA琼脂糖环氧树脂、L-精氨酸、L-瓜氨酸、DL-鸟氨酸、茚三酮、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG）、盐酸卡那霉素（Kan），生工生物工程项目（上海市）股权有限责任公司；T4DNA连接酶、约束性内切酶BamHＩ、SalＩ，TaKaRa企业；麦曲、酒药，浙江省塔牌黄酒企业。

1.2 方式

1.2.1 鸟氨酸氨甲酰基转移酶的复制

短乳酸杆菌OTC酶的正方向引物设计编码序列为：5’-cgcggatccATGACTAAGGATTTTCGGGAAAATGTA-3’（下横线为BamHＩ鉴别编码序列），反方向引物设计编码序列为：5’-acgcgtcgacTTAAGCTCGTGGAATGAATAAGTTACCT-3’（下横线为SalＩ鉴别编码序列）。以短乳酸杆菌的基因DNA为模版开展基因扩增，PCR物质经1%琼脂糖电泳电泳原理认证后开展提纯。

1.2.2 资产重组表述质粒的搭建

选用约束性内切酶BamHＩ和SalＩ各自对短乳酸杆菌OTC基因片段和媒介pET-28a开展双酶切。酶切物质经检测试剂盒回收利用后，联接并转换大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞，施胶在含卡那霉素的LB平板电脑上，经菌体PCR认证后，挑选获得呈阳性复制，并转录组测序评定目地基因序列。

1.2.3 资产重组鸟氨酸氨甲酰基转移酶的诱发表述与分离纯化

挑菌呈阳性单菌体注射于5mL含卡那霉素的LB培养基中，于37℃，200r/min震荡塑造留宿。按1%（摩尔分数）接种量接转于200mL的LB培养基中，再次于37℃，200r/min震荡塑造，至OD600nm做到0.6～0.8时，添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG），于25℃，180r/min诱发塑造留宿。离心式搜集菌体后，添加30mL缓冲溶液（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/LＩmidazole，pH8.0）重悬菌体，接着冰水浴超声波粉碎体细胞，于4℃，12000r/min离心式20min，得到上清液。参考Ni-NTA琼脂糖环氧树脂的应用说明方法，选用亲和层析提纯重组蛋白，接着运用SDSPAGE检验蛋白质纯净度及分子质量。

1.2.4 米酒酿制全过程及实验解决方式

以0.8kg檽米为原材料，30℃下浸米2d，高溫蒸制后制冷，添加160g麦曲和1.6g酒药及0.96L水，搅拌均匀后于28℃发醇。以未作任意解决的当然发醇米酒做为对照实验（CK），在发醇第5天添加提纯后的鸟氨酸氨甲酰基转移酶（5D），在发醇第12天添加同样浓度值的鸟氨酸氨甲酰基转移酶（12D），剖析较为发醇全过程中EC以及有关类化合物的差别。

1.2.5 羟基甲酸乙酯的HPLC-FLD测量

测定法参考Fu等[3]的报导，试品与0.1mL，1.5mol/L硫酸和0.2mL，0.01mol/L占吨醇正丙醇水溶液衍化后，根据高效液相色谱色谱分析检验。以工业甲醇和水做为流动性相，莹光探测器激起光波长233nm，发送光波长600nm，梯度方向过柱气相。

1.2.6 尿素溶液、瓜氨酸和鸟氨酸氨甲酰基转移酶活的测量

尿素溶液和瓜氨酸的检查方式各自参考陈宜宜等和Boyde等的参考文献上述，根据与铬黑T的显色反应来检验发酵物中的成分。
取发酵物超声波15min粉碎体细胞，于4℃，12000r/min离心式20min，取上清为原蛋白质提取液。依据茚三酮显色反应来测量OTC酶活，蛋白质成分则选用Bradford法完成测量。本实验中OTC酶活界定为每分水解反应1mg蛋白造成1μmol鸟氨酸所须要的酶量为一个酶活企业。

1.2.7 米酒基本物理化学质量的检测分析

1.2.7.1 米酒中分散碳水化合物的含水量测量

选用日本日立L-8900碳水化合物检测仪开展测量。检验基本原理为选用茚三酮做为衍化剂与碳水化合物衍化后检测分析。前解决办法为：取50mL米酒试品，加0.1mol/L盐酸溶液超声波震荡5min，加5%磺酸水杨酸钠除去蛋白质，离心式后选用氮吹仪浓缩，加0.02mol/L硫酸2mL，震荡后过膜，上机操作检验。

1.2.7.2 挥发物口味成分的检验

将8mL酒样和0.2gNaCl添加顶空罐中，50℃下磁力搅拌加温15min后，将提纯头插进顶空罐中，再次于50℃下加温30min后入样。GC色谱仪标准：载气为N2，流动速度为1mL/min，无分离气相；程序升温：原始柱温40℃，维持5min，以5℃/mL的速度加热至230℃，维持10min。气相口溫度250℃，GC分析時间2.5min。质谱分析标准：电子器件负电子离子源（EＩ）电子能量为70eV，离子源溫度250℃，插口溫度250℃，检验口工作电压为350V。扫描仪方法为全扫描仪，质量范围为35～350。

1.2.7.3 电子器件舌味蕾剖析

相对性于感观鉴评方式，电子器件舌完成了酸、苦、涩、咸、鲜和清甜味等基本上味及回味无穷的智能化点评，具备結果平稳且受影响小的优势。

加入适量被测试品放置电子器件舌检测杯里，对其酸、甜、苦、涩、咸、鲜等基本上味及回味无穷开展测量，不一样味蕾与感应器一一对应，全部感应器各自在对照品水溶液和米酒试品中泡浸、清洗，测得电势差值Vr和Vs，根据对Vs-Vr值的测算，就可以对米酒的酸、甜、苦、涩、咸和鲜香等基本上味和回味无穷开展剖析。每一个试品反复测试4～5次，为降低系统偏差，选后3次列入数据统计分析。

1.2.8 数据信息数据分析

每一个实验反复3次，选用SPSS手机软件对标值开展差别显著性分析。