2.2 HPLC法检验PQQ

本试验最先分析了别的离子交换柱检验PQQ，結果发觉一般C18柱没法使PQQ合理保存，拆换流动性相工业甲醇和乙腈，或是是梯度方向过柱都不可以保存PQQ。此外发觉更改pH能够使PQQ有一定的保存，但峰形较弱，且托尾比较严重，而且无法非常好分离出来试品发酵物中的PQQ。充分考虑PQQ正负极很大，因而选用耐100%水的COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ正相反离子交换柱来使PQQ有有效的保存。将准备好的七个不一样含量的PQQ标准物质（100，50，25，12.5，6.125，5，2.5 mg/L）开展HPLC检验，每一个浓度值持续气相3次，每一次气相20 μ L。結果如图所示1所显示。不一样含量的PQQ均在3.56 min上下出峰。伴随着PQQ浓度值的提升，峰总面积也逐步提升。因而PQQ浓度值与峰总面积呈成正比的关联。以PQQ浓度值为横坐标轴，色谱仪峰总面积为纵轴，制作标曲，线性相关为y=30.27x 7.32，R2=0.9998，表明线性相关优良。选用COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ正相反离子交换柱检验PQQ，运作时间较短，PQQ出峰時间早，检验高效率。本研究创建的HPLC法检验PQQ具备优良的可行性分析，可做为菌苗产PQQ的复筛方式。

2.3菌种的挑选和评定

经光谱法初筛，从100好几个试样中挑选到50多枝PQQ造成菌，大部分的生产量在2~5 mg/L，极少数能够做到10 mg/L上下，HPLC复筛后在其中PQQ生产量最大的1株为20.6 mg/L，峰图如图2所显示，PQQ在3.57 min出峰，这也是没经提升已报导的摇瓶较高生产量。

该菌种的菌体在工业甲醇培养液平板电脑上为奶白色，浓稠的，边沿齐整，直徑较小，为1~2 mm。菌细胞为球形，革兰氏阳性菌呈阴性，不产芽胞，有荚膜，无微绒毛。该菌种在以工业甲醇和甲胺为氮源的培养液中可以优良生长发育，能运用D-葡萄糖水，绵白糖，葡萄糖和麦芽糖醇。在以氨盐、磷酸盐、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏为氮源的培养液里能较好生长发育。选用PCR技术性增加该菌种的16s rDNA 基因序列，经上海生工转录组测序。根据在 NCBI网址中开展开放阅读框编码序列检索及核对，从这当中选择开放阅读框较高菌种的16s rDNA基因序列，以集团公司外菌苗作对比，根据MEGA手机软件，用临接法（Neighbor-Joining）搭建系统发育树。結果如图所示3所显示，该菌种与 Methylopila henanensis strain LYBFD3-16A2的开放阅读框最大，为99%。综合性菌体及菌体形状特点、16s rDNA序列剖析，评定该菌种为Methylopila sp.菌种，取名为Methylopila sp.Z1。

2.4 工业甲醇成分的提升

科学研究工业甲醇的差异加上浓度值（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）对OD600和PQQ生产量的危害，結果如图4所显示。在0.5%~2.5%的含量范畴内，伴随着工业甲醇容积含量的提升 ，菌体OD600和PQQ生产量也慢慢提升，当工业甲醇浓度值为2.5%时，OD600和PQQ生产量均实现最大，再次提升工业甲醇浓度值，OD600和PQQ生产量均有显著降低。这是由于工业甲醇做为病菌生長的唯一氮源，而且或是细菌细胞工业甲醇脱氨酶的底物，在其浓度值较低时，不能给予动能使细胞生长，也不能生产制造过多的PQQ代谢到培养液中，造成PQQ生成高效率极低。当工业甲醇浓度值慢慢增强时，体细胞能够使用的氮源提升，菌体OD600和PQQ生产量也逐步提升；当工业甲醇浓度值超出2.5%时，因为工业甲醇的毒素使体细胞损害，而且底物浓度值过高抑止工业甲醇脱氢酶的活性，造成菌体OD600和PQQ生产量降低。因而，2.5%的工业甲醇容积浓度值针对菌体生长发育和PQQ生成是最好的选择。

3 结果

现阶段PQQ的检查办法具体有资产重组酶法，氧化还原反应法，光谱法和HPLC，在其中资产重组酶法常用到的葡萄糖水脱氨酶获取繁杂，提纯全过程繁杂，且取得的酶活不高，不能适用很多的菌苗挑选；氧化还原反应法中使用到的铬黑T钛酸异丙酯氟苯四氮唑蓝（NBT）易受培养液中别的成份的影响，导致呈阴性結果。光谱法实际操作简易，检验迅速，但也有可能遭受培养液中有着类似光波长OD值的危害，但本试验使用的是工业甲醇无机物培养液，并根据HPLC检验试品发觉，基本上沒有影响，因而光谱法做为PQQ造成菌的初筛是高效率有效的。本试验还构建了新的HPLC法检验PQQ，选用亲水性离子交换柱COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ，促使PQQ有有效的保存，而且试品运作时间较短，PQQ在3.56 min出峰，出峰時间早，现场采样短，峰形无托尾，为PQQ检验给予一种新的改善方式。

因为PQQ的微生物生成原理沒有取得彻底诠释，根据基因工程技术和新陈代谢更新改造提升PQQ的生产量远小于野山菌的生产量，因而从自然环境中挑选具备增产PQQ工作能力的菌株是十分必要的。本试验从试品中挑选到一株PQQ增产菌，经评定为Methylopila sp.属，取名为Methylopila_sp. Z1，没经提升的摇瓶生产量做到20.6 mg/L，归属于已报导的较高质量。Z1菌种承受较高工业甲醇，在培养液工业甲醇浓度值为2.5%时，PQQ生产量达26.7 mg/L，对比于原始浓度值提升了28%。Z1是一株有增产PQQ发展潜力的菌种，事后发酵设备塑造和提升加工工艺将进一步提高PQQ生产量。