乳酸菌乳革兰阴性杆菌胞外含糖量（EPS）为乳酸菌饮料在成长新陈代谢全过程中代谢到植物细胞外的一类核甘酸化学物质。因为乳酸菌饮料对比别的工业级菌安全系数高，故近些年对乳酸菌饮料胞外含糖量的分析也慢慢增加。从现有的分析效果看来，生成EPS的乳酸菌饮料中乳酸菌乳革兰阴性杆菌生成工作能力较强，为80～600mg/L。胞外含糖量做为食用添加剂，可用于多种多样食品类的增粘剂、增稠剂、破乳剂和膏剂；具备生物活性如免疫力活力、抗癌和抗溃烂，可使用于药业行业，相对分子质量大概为4.0×10⁴～6.0×10⁶中间。虽然一直以来学者们对乳酸菌饮料产EPS的有机化学构成存有着矛盾，可是较一致觉得：从乳酸菌饮料中剥离获得的胞外高聚物是由α-和β-联接糖反复模块所构成的含糖量，而且不一样乳酸菌饮料代谢的EPS种类不一样。尽管单糖构成很有可能有一些类似，多见半乳糖、葡萄糖水和鼠李糖，可是各成份比例不一样。因为提取液中EPS的生产量较低、蛋白质含量较高，给EPS的获取产生比较大艰难。因而，发酵物中获取EPS加工工艺重要就是蛋白的去除与EPS的沉积，可获得平稳、易使用、残渣少的含糖量商品。本研究对乳酸菌乳革兰阴性杆菌发酵物根据不一样的标准开展获取提纯EPS，认证最好除蛋白质标准和含糖量沉积标准，为工业生产乳酸菌饮料胞外含糖量确立理论基础。

一、原材料与方式

1、原材料与实验试剂

乳酸菌乳革兰阴性杆菌乳亚种LL9（下称乳革兰阴性杆菌LL9）：郑州轻工业学校试验室给予，由乳酸菌乳革兰阴性杆菌乳亚种6242（我国的工业技术微生物菌种菌种保藏管理处（CICC））紫外线诱变，经葡萄糖水承受及乳链菌肽承受水准挑选挑出来，较为生物活性最后筛选活力高、乳链菌肽生产量高的最优控制菌种。

分离纯化标准为：发酵物→加上三氯乙酸至2.5%（w/v）→500r/min拌和5min→4℃沉积除蛋白质20min→10000r/s离心式20min除菌体→上清液分析12h→苯酚硫酸法测量EPS。可获得乳酸菌饮料胞外含糖量的总产量为262.63mg/L。

6%的甲酸水溶液：精准称量6.0g重蒸酚结晶，用少许的纯净水融解后倒进100mL的容量瓶中，滴定剂、充足混匀，倒进深棕色玻璃烧杯中预留。

2、实验方法

（1）菌种活化

储存于凡士林管内乳革兰阴性杆菌LL9注射于MRS液体培养基内，37℃塑造，传代2～3次后，上色镜检查，选择优质菌种，接转斜坡塑造，4℃冷藏室储藏预留。

（2）摇瓶发醇

活性后菌液5%转到摇瓶发醇，37℃控温150r/min波动塑造24h。

（3）发酵物解决

取发醇终点站发酵物，10000×g下离心式8min除去菌体，取上清液预留。

（4）苯酚硫酸法测量

EPS该办法较合适乳酸菌饮料EPS检验，相对偏差为0.2%，具备不错的精确性。透析液经稀释液取2.0mL添加1.0mL6.0%的甲酸水溶液，5.0mL95.0%的硫酸，静放10min，快速震荡器上震荡混匀，静放20min至制冷。490nm测量OD值。标曲上搜索相匹配糖成分，即得乳酸菌饮料胞外含糖量生产量。

（5）获取提纯生产流程

斜坡→MRS液体培养基活性2次（37℃，24h）→摇床扩张塑造（37℃，150r/min，24h）→离心式除去菌体（5mL，10000×g，8min）→加上三氯乙酸50%（w/v）（12h）→500r/min拌和5min→离心式沉积除蛋白质（4℃，18000×g，30min）→上清加酒精沉积含糖量（100%，3倍容积，4℃，解决12h）→离心式（12000×g，30min）→低温干燥→沉积温开水融解（稀释液10倍）→分析MD34（4℃，解决12h）→甲酸-硫酸测定方法OD值→EPS纯净度评定

二、結果与剖析

1、苯酚硫酸法标曲制作

用葡萄糖水做为规范物，制作标曲。由图1得知，糖浓度值在0～32mg/L时，糖浓度值和透光性呈线性相关。

2、除蛋白质标准提升

（1）除蛋白质中三氯乙酸浓度值的提升

将发酵物根据离心式的办法去除菌体后，各自添加30%、40%、50%的三氯乙酸水溶液1/5容积，讨论不一样三氯乙酸浓度值对蛋白沉积的危害，如图所示2所显示。三氯乙酸浓度值在30%～50%时与发酵物含糖量生产量呈正比例关联，三氯乙酸浓度值过过高对含糖量的构造造成危害，因而基本明确除蛋白质环节三氯乙酸的最佳浓度值为50%。

（2）除蛋白质中向心力提升

本实验操作中发酵物体细胞分离出来后，添加50%的三氯乙酸水溶液1/5容积，各自在10000×g、12000×g、13000×g、16000×g向心力下离心式30min，选择最优控制离心式标准，如图所示3所显示。在向心力16000×g时，含糖量得率超过最高值，选16000×g为最佳向心力。