目地 研究上千年草提取液的清除自由基活力及对人会纤维细胞胶原生成的危害以及延缓衰老功效。方式 各自选用开水和酒精获取上千年草的籽、皮和茎，得到提取液干冻粉末。检验上千年草的籽、皮和茎的开水提取液、酒精提取液的1,1二苯基-2三磺酰氯肼(DPPH)消除活力、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)消除活力。选用上千年草提取液和人肌肤纤维细胞共培养，选用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFHDA)荧光探针试剂盒检测上千年草提取液对人会肌肤纤维细胞内臭氧(ROS)消除活力，检验上千年草提取液对人会肌肤纤维细胞的繁衍功效及对Ⅰ型胶原生成的危害。結果 上千年草种、皮、茎的开水提取液和酒精提取液均具备DPPH、ABTS和体细胞内ROS消除活力，伴随着浓度值提升，清除率上升，上千年草种酒精提取液的DPPH和ABTS消除能力最强，其IC50各自为(47.96±5.18)μg/ml、(33.48±3.25)μg/ml。10μg/ml之上浓度值的上千年草提取液对人会肌肤纤维细胞繁衍均有一定的推动作用，上千年草种的酒精提取液和开水提取液的推动作用最強。

上千年草提取液对人会肌肤纤维细胞Ⅰ型胶原的生成具备推动作用，随含量提升推动作用提高，在其中，浓度值为50μg/ml的上千年草种开水提取液推动作用越强。结果 上千年草开水提取液和酒精提取液均具备抗氧化性活力、推动人肌肤纤维细胞Ⅰ型胶原的合成作用，在其中上千年草种的活力最強，能推动细胞的增殖，无显著细胞毒性。

上千年草是发育在韩国济州岛、牙山等地的一种仙人球，被称作"手耳光仙人球",是一种可食用仙人掌。该种类块头偏矮，果子为鲜红色，具备较强的御寒工作能力，能承受-5℃的极寒。其果实含有各种蛋白、维他命、营养元素等，营养丰富，仙人球还具备抗菌、消肿、提高免疫力、降血脂、抗脂质过氧化、推动新陈代谢等多种多样功效与作用，临床医学普遍用来医治消化不好、胃疼、急性肠炎、痔血、干咳、糖尿病患者等各种病症。除开服用使用价值和功效与作用，科学研究报导仙人掌果实具备抗氧化，能加快伤口痊愈，延缓衰老，提升肌肤的柔软性，填补肌肤水份避免皮肤干，是日常护肤的上品。本科学研究各自根据开水和酒精获取上千年草的皮、茎和籽，研究各种各样上千年草仙人球提取液身体之外抗氧化性功效，及体细胞内消除臭氧(ROS)功效，对细胞分化功效，对胶原生成的危害。

1 原材料与方式

1.1 原材料与实验试剂

上千年草仙人球、1,1二苯基-2三磺酰氯肼(DPPH)、甲酰胺二异丁脒盐酸盐(AAPH)购自Sigma 企业；人肌肤成化学纤维细胞系 HSAS1购自继和生物技术，其他化学药品均为分析纯。电子分析天平购自上海精密仪表设备有限责任公司；电加热控温鼓风干燥箱上海精宏实验仪器有限责任公司；RE-5299(2L)旋转蒸发器佛山市瑞力仪器设备有限责任公司；紫外线分分光光度计上海市棱光技术性有限责任公司；艾本德 5810R台式一体机离心机；超声波清洗器昆山市超声波仪器设备有限责任公司。

1.2 获取加工工艺

上千年草分成籽、皮和茎三一部分，经统一干躁，破碎，过60目筛，获得相应的上千年草仙人球籽、皮、茎粉末状。水提液：各自称上千年草仙人球籽、皮、茎粉末状各10 g, 各自添加250 ml 65℃开水，60℃水浴、200W超声波输出功率泡浸获取1 h, 抽虑，反复以上流程3次，合拼渗沥液，以3 000 r/min离心式10 min, 取上清液预留。酒精提液∶各自称上千年草仙人球籽、皮、茎粉末状各10 g, 各自添加250 ml 60%酒精，60℃水浴、200 W超声波输出功率泡浸获取1 h, 抽虑，反复以上流程3次，合拼渗沥液，以3 000 r/min离心式10 min, 取上清液预留。水提液和酒精提液各自在60℃下缓解压力转动挥发为10 ml, 经低温干燥各自获得籽、皮和茎的干躁粉末状。

1.3 DPPH消除活力

在96填料中先后添加不一样含量的上千年草开水提物和酒精提物100 μl和DPPH水溶液，遮光置放孵育30 min后，在517 nm光波长处测量其OD值(A1)。以等容积纯净水取代DPPH水溶液，按以上流程实际操作，测量OD值值A2。以等大小的95%酒精替代试品水溶液做为空白试验，按以上流程实际操作，测量OD值(A3)。以Vit C(VC)为阳性对照，DPPH氧自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%,测算半抑止浓度值IC50。

1.4 2,2联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)消除活力

在96填料中先后添加不一样含量的上千年草水提物和醇提物250 μl和ABTS水溶液50 μl, 遮光置放孵育6 min后，在734 nm光波长处测量其OD值(A3)。以等容积纯净水取代ABTS水溶液，按以上流程实际操作，测量OD值值A4。以等大小的95%酒精替代试品水溶液做为空白试验，按以上流程实际操作，测量OD值(A5)。以VC为阳性对照，ABTS氧自由基清除率(%)=[1-(A3-A4)/A5]×100%,测算半抑止浓度值IC50。

1.5 人肌肤纤维细胞塑造

将恢复后的人肌肤纤维细胞放置含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中开展传代培养，每2 d拆换1次细胞培养液，塑造至对数期。

1.6 上千年草提取液体细胞内

ROS消除活力将传代培养至第48代的人肌肤纤维细胞配置成5×104个/ml的体细胞混液，于96孔塑造板注射，塑造24 h 后各自采用不一样含量的甲酰胺二异丁胀盐酸盐(AAPH)水溶液解决2、4、6、8 h, 选用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯 (DCFHDA)检测试剂盒测量 ROS臭氧消除工作能力，全部实际操作严苛依照检测试剂盒使用说明开展，明确AAPH最好造模浓度值和解决時间。以最好的AAPH浓度值和造模時间为实体模型，37℃5%CO2塑造，在体细胞贴壁培养24 h后各自添加1、10、50、100 μg/ml浓度值的开水提物和酒精提物塑造1 h(对照实验添加等容积血清蛋白)后，添加最好AAPH造模浓度值开展最好解决時间解决，交通事故结案后，去除AAPH,聚磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗，再添加新鮮无血清蛋白培养液再次培育至16 h, 应用2 μl DCFHDA荧光探针检测试剂盒开展ROS臭氧消除工作能力检验，应用莹光光度计检验照相，激起光波长为485 nm, 发送光波长为530 nm。

1.7 上千年草提取液的细胞的增殖功效

配备1.6中体细胞混液于96孔塑造板注射，待体细胞贴壁生长发育24 h后各自添加1、10、50、100 μg/ml浓度值的水提物和醇提物，每一个浓度值设定3个平行面样，对照实验添加等容积空缺血清蛋白，37℃ 5%CO2塑造72 h, 用PBS清洗，再添加2 mg/ml的噻唑蓝(MTT)水溶液30 μl, 再次塑造4 h, 去除上清液，添加150 μl DMSO,充足波动，于570 nm光波长下测量其OD值值，与空白试验较为，测算体细胞增殖率。

1.8 上千年草提取液对胶原生成的危害

将2 ml塑造至对数期的人肌肤纤维细胞以3×105个/ml浓度值嵌入含有盖玻片的塑造版中，盖玻片在塑造前经多聚赖氨酸解决，用含10% FBS的DMEM细胞培养液，塑造24 h后，各自添加1、10、50、100 μg/ml浓度值的上千年草开水提物和酒精提物，每一个浓度值设定3个平行面样，对照实验添加等容积血清蛋白，塑造7 d后，应用 PBS缓冲溶液清理盖玻片，随后用5%甲苯固定不动，应用H2O2除去乳酸脱氢酶，添加一抗，37℃下孵育2 h, 添加二抗，二羟基联苯胺(DAB)着色，选用苏木素复染细胞质，中性化虫胶封固。应用显微镜观查，以黄棕色为呈阳性，每一张盖玻片任意挑选10个视线开展观查，根据LEICAQ手机软件开展灰度级剖析，观查Ⅰ型胶原的表述，灰度级越低表明Ⅰ型胶原成分越高。

1.9 统计学方法

选用SPSS19.0手机软件开展χ2检测、单要素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1 DPPH、ABTS消除活力

上千年草种、皮、茎的开水提取液和酒精提取液的DPPH、ABTS清除率均伴随着含量的提高而上升(P<0.05)。上千年草提取液的DPPH、ABTS清除率均显著小于同样浓度值的呈阳性对照实验(P<0.05)。见表1、表2。上千年草各一部分提取液的DPPHIC50、 ABTS IC50值均显著高过呈阳性对照实验(均P<0.05),上千年草各一部分提取液中，上千年草种酒精提取液的DPPH、ABTS消除能力最强，见表3。