2 水环境治理中病原菌的无损检测技术

近些年，水环境治理中病原菌的检验获得了一定的研究成果，已从单一根据塑造法的传统式病原菌检验方式发展趋势至多种多样生物学检验方式 ，这种技术性的发生和发展趋势为病原菌检验带来了新的构思。水环境治理中病原菌无损检测技术的发展趋势见图 1。

现阶段最大多数的病原菌检验方式是塑造法和聚合酶 链 式 反 应 ( Polymerase Chain Ｒeaction， PCＲ) 。这 2 种方式在可选择性和敏感度层面都很突显，但塑造法比 PCＲ 法更用时。一些新起的方式如生物传感器已经研发中，其以后的发展趋向是达到成本低、高可选择性规定。转录组测序因为扩散系数高和不必非特异引物设计等优势正逐步代替传统式检验方式 ，但也存有差错率高局限。近些年病原菌检验办法的检出限以及运用见表 2。现阶段，病原菌检验方式还存有类似亚种无法区别、高致病及试品浓缩产生的抑止物等难题，这对新检验办法的研发是很大挑戰。

2． 1 PCＲ 和即时定量分析 PCＲ PCＲ 是现阶段病原菌检测中运用最普遍的分子结构

分子生物学方式之一，其根据增加特殊的靶基因序列来进行病原菌检验。关键根据转性、淬火和拓宽( 淬火和拓宽还可以一起开展) 3 个流程最后达到目标编码序列的指数值变大。我国出入境签证检验检测国家标准( SN/T 1896—2007) 中选用 PCＲ 技术性对食物中的各种病原菌( 沙门菌、志贺氏菌、橙黄色链球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增长李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠渗出性肠子埃希氏菌 O157: H7、副血溶弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌) 开展迅速判定检验。

实 时 定 量 PCＲ ( quantitative real-time PCＲ， qPCＲ) 是在 PCＲ 技术性基本上运用莹光数据信号值即时检验目的基因，根据内参或外参法对样本中的特殊遗传基因开展定性分析，比基本 PCＲ 更加灵巧。已经有大量的科学研究选用 qPCＲ 方式定量分析病原菌，如大肠杆菌和沙门菌 等。各自选用qPCＲ 方式与传统式塑造法检验仙河镇水质采样中大肠埃希菌和肠 球 菌，发 现 qPCＲ 方式的检出限能做到1 CFU/100 mL，明显好于传统式塑造法。可是 qPCＲ也存有 DNA 回收利用高效率低和对引物设计非特异规定高的难题。除此之外，qPCＲ 在检测中还遭遇别的一些挑戰，如反映中存有 PCＲ 抑止物。即便小量的PCＲ 抑止物也会延迟时间繁杂试品的阀值循环系统( Cq ) ，进而造成模版拷贝数比具体值低。为避免假阴性結果的发生，可在 PCＲ 反映中添加对抑止物具备高灵敏的內部阳性对照( 如内参基因) 开展检验。除此之外，获取全过程中残存的抑止物如胍盐和甲酸可选用 QuickDrop 和 NanoDrop 光度计检验，还可以根据凝胶电泳明确是不是有 ＲNA、DNA 及蛋白质环境污染。假如试品中带有蛋白质等其它杂物的环境污染，能够采用磁珠开展核苷酸提纯。此外，qPCＲ 无法识别活菌或死菌，会造成阳性結果。现阶段，一般 采 用 叠 氮 溴 化 丙 锭 ( propidium monoazide， PMA) 对试品开展前理，进而防止阳性結果的造成。PMA 是一种高宽比感光的 DNA 融合染剂，不可以通过完善的活细胞质，却能可选择性地通过不详细的死细胞质。PMA 能与 DNA 融合产生不可逆化学键，抑止死细胞 DNA 的增加以做到区别死、体细胞的目地。

除此之外，PCＲ 与 qPCＲ 针对病原菌的大批量检验存有一定的局限。对于以上难题，多种 PCＲ、微滴 式 数 字 PCＲ 等技术性陆续造成。多 重 PCＲ ( multiplex PCＲ，mPCＲ) ，又被称为多种引物设计 PCＲ 或复合型 PCＲ，是在同一 PCＲ 反映管内与此同时再加上多种多样非特异引 物 进 行 PCＲ 扩 增。微 滴 式 数 字 PCＲ ( Droplet Digital PCＲ，ddPCＲ) 是第三代 PCＲ 技术性，归属于单分子结构剖析，可用以肯定定量分析。用 ddPCＲ 和 qPCＲ 记数江河自然环境中的沙门菌，发觉水里 ddPCＲ 的精确度和线形范畴与 qPCＲ 非常，但堆积物试样中 ddPCＲ 的精确度和线形范畴显著高些。多种 PCＲ 和微滴式数据 PCＲ 技术性都解决了传统式 PCＲ 方式高成本费、扩散系数比较有限、步骤繁杂、精准度劣等缺陷。可是 mPCＲ 存有多总体目标增加标准不兼容的难题，ddPCＲ 检验浓度较高的试品时的线性显著降低。

2． 2 等温扩增技术性

近些年新发展起來的等温扩增技术性，不论是操作过程或是仪器设备规定层面都比 PCＲ 技术性更加简洁便捷，在临床医学和当场检测中有着优良的市场前景，在其中，环受体等温扩增( LAMP) 早已获得一定的运用。该技术性是一种新式的核苷酸增加方式，其具体机理是应用 4 条非特异引物设计各自鉴别靶DNA的 6 个特殊地区，根据链置换反应完成等温过程标准下遗传基因的迅速增加。该办法的特点是敏感度高( 检出限比传统式的 PCＲ 方式低 2 ～ 5 个量级) 、反应速度短( 30 ～ 60 min) 、临床医学应用不用独特仪器设备和使用简易( 反映液、酶和模版的溶液放置 63 ℃ 上下恒温水浴锅或恒温箱中 30 ～ 60 min) 。应用改性材料的 LAMP 定性分析地面中的大肠埃希菌和伤寒论沙门菌，敏感度采样率为 0． 3 ～ 10 000 cells/mL，浓度较高的抑止物对定量分析結果危害较小，且 1 h 内可以进行检验。LAMP 技术性根据 4 ～ 6 个引物设计的融合，因此比 qPCＲ 增加高效率低，也经常因非特异性增加发生阳性結果。现阶段较常用的避免阳性結果产生的办法具体包含:

( 1) 应用特殊构造的PCＲ 管，该管内有一个稳定的小挡板将管分为 2 个地区，各自添加反映液和 DNA 染剂，但这些办法提升了加液频次，不适感用以大批检验;

( 2) 将染剂包埋在石腊中，反映完成后高溫熔融石腊从而释放出来染剂，但该方式提升了前解决時间。