2.3 资产重组菌全体细胞转换制取GABA的技术提升

2.3.1 溫度对资产重组菌全体细胞转换生产制造CABA的危害

酶法制取GABA是一个不可逆反应，适合的气温能够使GABA转换率做到较大，因此 利用设定不一样的酶转换溫度来研究溫度对GABA转换率的危害。以100g/L的磷酸为底物，溶解双蒸水中，添加湿菌体(在55℃恒温水浴锅预备处理50min，改进细胞的渗透性)30U/g，在150r/min的水浴摇床中开展转换，反映历程中，操纵pH为5.0。温度场设定为25、30、35、40、45、50℃，反映24h后停止反映并开展烧开解决，12000r/min离心式5min得上清液，适度稀释液并过0.22μm有机滤膜完用HPLC-OPA柱前衍化法开展检验，結果见图9。转换率随环境温度上升慢慢提升.当转换溫度做到40℃时，GAD-0和GAD-PL转换率做到最大，各自为64.78％和82.27％，再次上升溫度，转换率反倒减少。这是由于枯草枯草芽孢菌植物细胞厚，而反映溫度过低时，底物与胞内酶液没法充足触碰促使转换率低：当反映溫度过高时，酶与PLP可靠性差，进而危害GABA的转换率。

2.3.2 DH对资产重组菌全体细胞转换生产制造GABA的危害

以100g/L的磷酸为底物.溶解双蒸水中，添加预备处理过的湿菌体30U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床巾开展转换，反映历程中，每过2h用0.6mol/L的H₂S0₄或NaOH调整pH，使其一直与原始pH保持一致。pH梯度方向设定为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反映24h后停止反映并开展烧开解决，12000r/min离心式5min得上清液，适度稀释液并过0.22μm有机滤膜完用HPLC-OPA柱前衍化法开展检验。結果见图10，当pH为4.5或5.0时，GABA转换率最大，GAD-0的GABA转换率为75.45％和76.21％，GAD-PL的GABA转换率为84.54％和84.21％。当DH低于4.5时，底物-水谷氨酸钠在弱酸性情况下非常容易酸水解反应转化成磷酸进行析出，进而产生奶白色混浊液态.不利酶与底物的完全融合；当pH超过5.0时不利酶促反应巾心的磷酸氢钙残基以shifft-碱与PLP、底物融合，进而抑止GABA的转化成。由此可见，酶转化法制取GABA的pH承受范畴窄，偏酸或过碱都不利酶促反应开展，考虑到在高品质浓度值底物下，过低的pH更非常容易造成底物进行析出，因此 酶转换适宜pH为5.0。

2.3.3 加菌量对资产重组菌全体细胞转换生产制造GABA的危害

以100g/L的磷酸为底物，溶解双蒸水中，添加预备处理过的不一样湿菌体(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴摇床中反映24h，反映历程中，操纵pH为5.0。反映完成后开展烧开解决，12000r/min离心式5min得上清液，适度稀释液后用碳水化合物柱前衍化法开展HPLC检验。結果见图11，资产重组菌全体细胞转换率伴随着加菌量的提高而逐步提升，在其中GAD-PL和GAD-0分别在40U/g和50U/g时将底物彻底转换，转换率做到100％。GAD-PL的加菌量低于GAD-0是由于前面一种体细胞巾的PLP成分高过后面一种，PLP做为第二信使有益于酶促反应的开展。
 

2.3.4 反应速度对资产重组茵全体细胞转换生严GABA的危害

以100g/L的磷酸为底物，溶解双蒸水中，添加预备处理过的不一样湿菌体，GAD-0和GAD-PL添加量分別为50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反映24h，反映历程中，操纵DH为5.0。反映完成后开展烧开解决，12000r/min离心式5min得上清液，适度稀释液完用HPLC-OPA柱前衍化法开展检验，結果见图12。在0～20h，GAD-0和GAD-PL转换生成GABA的生产量随时随地问增加快速提升，在20h时转换率做到100％，以后伴随着反映开展，转换率不会再产生变化。

2.3.5 底物浓度值对资产重组菌全体细胞转换生严GABA的危害

以200g/L的磷酸为原始底物，溶解双蒸水中，添加预备处理过的不一样湿菌体，GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0为50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反映6h后，每过3h加补1.27g的磷酸共体至底物浓度值分別为200、250、300、350、400g/L，反映历程中，操纵pH为5.0，反映48h。反映完成后开展烧开解决，12000r/min离心式5min得上清液，适度稀释液并过0.22μm有机滤膜完用HPLC-OPA柱前衍化法开展检验。結果见图13，当底物浓度值做到400g/L磷酸时，GAD-0和GAD-PL转换生产制造GABA的转换率各自从100％(底物浓度值350g/L磷酸)降低为97.72％和98.43％。综合性考虑到，为提升工业制造高效率和节约中下游分离纯化成本费，挑选350g/L做为酶法制取GABA的适宜底物浓度值。

3 总结

创作者取得成功搭建并资产重组表述了带有Escherichiacoli来源于的gadB遗传基因的资产重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。试验说明在进行发酵全过程中加上0.5mmol/L辅酶磷酸激酶PL的GAD总酶活做到28.14U/mL，是对比总酶活的1.72倍。进一步提升资产重组菌全体细胞酶法生产制造GABA的技术标准，结果显示，当溫度为40℃，pH为5.0，GAD-0和GAD-PL的适宜加菌量各自为50U/g和40U/g时，GABA转换率做到100％。当磷酸浓度值为400g/L时，GABA生产量各自为275.60扎和273.61g/L。总的来说，创作者调查了菌体发醇塑造操作过程中加上辅酶磷酸激酶PL对资产重组菌产GAD及制取GABA的危害，开发设计了一种不用在进行发酵全过程和酶转换管理体系巾加上价格昂贵辅酶PLP就能高效率生产制造GABA的T艺技术性，为GABA在食品类和医药领域中的广泛运用奠定了夯实基础。