1.2.4 摇瓶发醇生产制造CAD及蛋白质检测

将-80℃储存的资产重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB以摩尔分数0.2％注射至含20μg/mL四环素的LB液体培养基中,振荡培养箱37℃、200r/min扩张塑造8～10h，再以摩尔分数5％接转至含20μg/mL四环素的TB发醇培养液中，振荡培养箱37℃、200r/min塑造2～3h后各自添加一定含量的PLP、PL、PN，于振荡培养箱33℃、200r/min开展资产重组蛋白的表述。发醇全过程中在不一样時间抽样，测0D₆₀₀。12000r/min离心式1min获得菌体和发醇上清液。将菌体用1mL、50mmol/L、pH5.0的Na₂HP0₄-柠檬酸钠缓冲溶液重悬，添加0.6mg/mL溶菌酶，在37℃反映30min后放置凉水中超声波粉碎，12000r/min离心式5min获得破壁料理机上清液和破壁料理机沉积，应用SDS-PAGE检验其蛋白。

1.2.5 资产重组CAD酶活测量底

物水溶液配置：0.1mol/L-水谷氨酸钠和0.15mmol/LPLP溶解50mmol/L、pH4.5的Na₂HPO₄-柠檬酸钠缓冲溶液中，放置4℃遮光储存。

反映管理体系：将配有360uL底物水溶液的1.5mLEP管于37℃恒温水浴锅加热10min后，添加40uLGAD粗酶液，在37℃下反映4min后，添加600uL、0.2mol/L、pH10的硼酸缓冲溶液停止反映，放置开水中消灭10min。

GABA产生量测量：选用HPLC-OPA碳水化合物柱前衍化法检验GABA产生量。

酶活界定：在反映液中，1min催化反应底物转换转化成1umolGABA需要的酶量为一个魅力企业(U)。

文中中资产重组GAD均指资产重组菌生产的GAD。

1.2.6 资产重组菌全体细胞制取GABA生产流程

1) GABA的制取

水配置浓度值为127g/L的一水谷氨酸钠底物(换算成100g/L磷酸，下列均以换算后的磷酸浓度值开展论述)。在150mL三角锥形瓶中添加20mL底物，添加一定量的湿菌体(在55℃恒温水浴锅预备处理50min，改进细胞的渗透性)，反映历程中，每过2h用0.6mol/L的H₂SO₄和NaOH调整pH，使其一直与原始pH一致。在一定溫度、pH下，150r/min水浴摇床中反映一段时间，停止反映后开展烧开解决，12000r/min离心式5min得上清液，适度稀释液并过0.22μm有机滤膜完用HPLC-OPA柱前衍化法开展检验。

2) GABA产生量的测量

将过虑好的试样根据HPLC检验GABA产生量。HPLC色谱仪标准以下：Agilent1200HPLC色谱分析仪、Agilent自动进样器、GLInertsilODS-3高效液相柱、Agilent紫外线探测器。流动性相A：精确量取995mL矿泉水，添加4.52g无水乙酸钠，拌和使其完全融解，再添加5mL四氢呋喃和0.2mL三乙胺，以后用冰乙酸调整pH至7.20±0.05，充足混和完用0.22μm无机物甲基纤维素滤纸过虑预留：流动性相B：精确量取200mL矿泉水，添加4.52g无水乙酸钠，拌和使其完全融解，用冰乙酸调整pH至7.20±0.05后，再逐个添加400mL色谱纯的乙腈和工业甲醇，用冰乙酸调整pH至7.20 0.05，混和完用0.22μm有机化学尼龙滤膜过虑预留。梯度方向过柱，总流量为0.8mL/min，柱温为40℃。依据消化吸收峰总面积和GABA标准物质峰面积换算GABA产生量，计算方法如下所示：

式中：Y为GABA转换率，％；4为磷酸转换转化成GABA的具体浓度值，g/L；T为磷酸转换转化成GABA的基础理论浓度值，g/L。

2 結果与探讨

2.1 产磷酸脱羧酶资产重组菌的搭建

以试验室储存的质粒pET-24a( )-gadB为模版，增加gadB目地精彩片段，并以质粒pHY300PLK为模版，增加表达载体精彩片段。增加获得的物质用琼脂糖电泳电泳原理检验，目地基因片段gadB和质粒表达载体pHY300PLK长短约为1428bp和5731bp，与基础理论碱基尺寸一致。认证准确后根据ExnaseⅡ连接酶将2个基因片段联接再转到E.coliJMl09感受态细胞，施胶到LB固体培养基(含氨苄青霉素抵抗性)后挑菌单菌体至LB液体培养基(含氨苄青霉素抵抗性)中留宿塑造。获取质粒，酶切认证和转录组测序取得成功后，将重组质粒用触电转化法导进表述寄主B.subtilis并施胶到LB固体培养基(含四环素抵抗性)，以后挑菌单菌体至LB液体培养基(含四环素抵抗性)中塑造8～10h，获取质粒后开展酶切认证剖析。結果见图3，各自在5130bp和2100bp上有突出的杂带，表明资产重组表述质粒pHY300PLK-gadB在B.subtilis中搭建取得成功。

2.2 各自加上辅酶及辅酶磷酸激酶对资产重组菌摇瓶发醇的危害

2.2.1 加上不一样类型辅酶及辅酶磷酸激酶对资产重组菌产酶状况的危害

类型辅酶及辅酶磷酸激酶对资产重组菌产酶状况的危害资产重组菌依照1.2.4开展摇瓶发醇产酶，摇瓶发酵温度33℃，在资产重组菌发醇全过程中分別加上辅酶PLP(通称GAD-PLP)、辅酶磷酸激酶PL(通称GAD-PL)和PN(通称GAD-PN)至终浓度值为0.5mmol/L。发醇完毕后12000r/min离心式1min得到菌体，用超音波体细胞破碎机开展体细胞粉碎，12000r/min离心式5min获得GAD粗酶液。結果见图4，诱发48h后，酶活各自做到25.40、28.14U/mL和15.55U/mL，是对比GAD-0酶活(16.34U/mL)的1.55、1.72和0.95倍。由此可见，加上0.5mmol/LPN时，酶活相比于对比并无显著差别，这是由于枯草枯草芽孢菌中缺乏PdxH抗霉素，没法根据PLP挽救方式将PN转换为PLP，进而提升GAD酶魅力。次之伴随着诱发塑造時间的增加，体细胞内生成的小量PLP被本身消化吸收并耗费而不能满足GAD表述水准提升 的必须 。殊不知向培养液巾加上适当的PLP或PL能够同时或问接根据PLP挽救方式生成PLP，进而给予可以保持GAD平稳的辅酶PLP，推动GAD的伸缩，提升酶活。由于PLP成本费高过PL，因此 在进行发酵全过程中选取加上PL开展事后试验。

2.2.2 不一样吡哆醛浓度值对资产重组菌产酶状况的危害

资产重组菌依照1.2.4开展摇瓶发醇，在操作过程中加入不一样含量的PL(0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.2、0.3mmol/L)发醇塑造48h后，12000r/min离心式1min得到菌体，超音波体细胞粉碎机开展体细胞粉碎，12000r/min离心式5min获得GAD粗酶液，結果见图5。伴随着PL浓度值的提升，GAD酶活也随着提升，当PL浓度值为0.1mmol/L时，GAD酶活做到最大为28.28U/mL。再次提升PL的浓度值，酶活并没有产生明显转变，故得知PL的适宜加上浓度值为0.1mmol/L。图6为发醇全过程中加入不一样浓度值PL后的资产重组GAD蛋白电泳图，从图上由此可见在相对性分子质量53000的杂带附近有一条清楚的蛋白电泳条带，合乎GAD基础理论蛋白相对性分子质量尺寸。

2.2.3 加上吡哆醛前后左右资产重组菌发醇全过程较为

资产重组菌依照1.2.4开展摇瓶发醇，在操作过程中加上0.1mmol/LPL，研究其在不一样发酵时间(0、12、24、36、48、60h)对资产重组菌生长发育(见图7)和产GAD状况(见图8)的危害。与GAD-0对比，在发醇时问36h上下，PL对菌体的成长有一定的推动作州，是由于存蛋白表述全过程中，根据PLP挽救方式，PdxK蛋白激酶将PL磷酸化产生PLP，推动GAD的伸缩，一定水平上有益于菌体生长发育。伴随着发醇时間的增加，南于PLP可靠性差而丧失功效,造成菌体的生长发育有一定的降低。由图8得知，与GAD-0对比，GAD-PL酶活最大做到28.28U/mL，加上适当的PL能够保证给GAD不明浓度值的PLP，进而提升GAD酶活。