γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白碳水化合物，是由磷酸脱羧酶不可逆、专一地将L-磷酸的α-羧基脱去-分子结构CO₂获得，是高宽比溶解水的两性离子，pK值为4.03和10.56，因而主要表现出与此类碳水化合物相近的身理活力，即做为一种抑制型递质存有于哺乳类动物的神经中枢体系中。现阶段普遍使用于工业生产、宠物饲料、药业和食品企业。

很多研究表明，GABA有有助于睡眠、提高记忆力、抗焦虑、防止和医治癫痫、减缓脑变老、缓解毛细血管、调整生长激素代谢、提升受胎率、消除氨毒、提高肝脏功能等功效。

现阶段制取GABA的办法具体有绿色植物聚集法、有机合成法、生物发酵法、酶催化反应法。绿色植物聚集法生产制造GABA尽管安全环保，但GABA浓度值低，尚没法作为药品、食用添加剂；有机合成法生产制造GABA安全系数较弱、有化工残余，也不容易做到药业及食品企业的规范：生物发酵法取得的GABA是一个多相繁杂管理体系，浓度值低，中下游物质分离出来成本增加，是生产制造高纯、浓度较高的GABA的一个发展瓶颈。因此 ，现阶段制取GABA多选用酶催化反应法，主要是使用微生物菌种体细胞内分离出来获得的磷酸脱羧酶或可以生产制造磷酸脱羧酶的微生物菌种体细胞专一、不可逆地脱下L-磷酸的α-羧基，进而获得浓度较高的、高纯的GABA。此办法的特点是反映标准柔和、不用高昂的原材料、耗能低，而且微生物菌种来源于的磷酸脱羧酶和可以生产制造磷酸脱羧酶的微生物菌种体细胞可利用简洁的细胞培养基很多获得。

现阶段大多数科学研究以大肠埃希菌为寄主表述GAD，催化反应生产制造GABA。在资产重组菌发醇全过程中加上一定含量的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)可以推动GAD的伸缩，进而提升GAD酶魅力。此外，酶催化反应法即运用GAD将磷酸脱去一分子CO₂制取GABA全过程中，在酶转换管理体系中加入一定量的PLP能够推动酶液或全体细胞的转换旧。有学者报导了在大肠埃希菌发醇全过程中同时加上0.02mmol/LPLP后，GABA生产量是对比的2.0～2.5倍。可是PLP价格比较贵，在进行发酵全过程和酶转换管理体系中同时加上毫无疑问大大增加产品成本。因为大肠埃希菌本身具有吡哆醛蛋白激酶(PdxK)遗传基因和硫酸铵吡哆醇抗霉素(PdxH)遗传基因，进而产生PLP挽救方式(见图1)。辅酶磷酸激酶吡哆醇(PN)、吡哆胺(PM)和吡哆醛(PL)上57羟甲基根据PdxK使其磷酸化，转化成相应的辅酶中问体硫酸铵吡哆醇(PNP)和硫酸铵吡哆胺(PMP)及其辅酶磷酸吡哆醛(PLP)，PdxH进一步催化反应PNP或PMP的氧化还原反应，转化成辅酶PLP，辅酶PLP的提升可推动GAD的伸缩，提升GAD酶魅力。黄燕等科学研究了在大肠埃希菌发醇全过程中加上PN后，酶活是对照实验(不加上PN)的1.8倍。

可是大肠埃希菌为非食品卫生安全菌种，在进行发酵全过程中容易造成类毒素，而且必须加上价格比较贵且有侵害功效的IPTG做为诱导剂诱发产酶，其生产制造取得的GAD安全系数不高，间距达到食品类和制药方面的需求也有一定差别。枯草枯草芽孢菌是根据美国食品和药物管理局GARS验证的安全性菌种，广泛运用在食品类、药业制造中。殊不知在枯草枯草芽孢菌中缺乏PdxH，因此没法运用加上辅酶磷酸激酶PN的方法，根据PLP挽救方式将PN转换为PLP，进而提升GAD酶魅力。现阶段，很多的科研集中化在以枯草枯草芽孢菌为寄主生产制造GAD，在酶转换流程中根据立即加上辅酶PLP提升转换高效率，如丁伟等应用安全性寄主枯草枯草芽孢菌生产制造GABA，在其转换全过程巾立即加上PLP，全体细胞催化反应GABA生产量为239.91g/L，转换率54.48％。因为PLP价格比较贵，造成产品成本较高，没法融入工业生产要求。有关在枯草枯草芽孢菌为寄主生产制造GAD发醇全过程中，加上质优价廉的辅酶磷酸激酶以提升GAD酶魅力的探究末见报导。因而创作者以枯草枯草芽孢菌(Bacillussubtilis)为寄主，根据基因工程技术将大肠埃希菌来源于的磷酸脱羧酶遗传基因(gadB)在B.sMbtilis中异源表述，加上相对性便宜的辅酶磷酸激酶PL，根据PdxK受体的PLP挽救方式将其转换转化成PLP(见图2)，进而提升酶活和生产量，减少产品成本。

1 原材料与方式

1.1 原材料

1.1.1 菌种和质粒

质粒EcoliJMl09/pET-24a( )-gadB为创作者所属试验室早期搭建，菌种B.5Mbtilis和表达载体pHY300PLK(含启动子P_HfpaH和P_armyQ，没有信号肽)由创作者所属试验室储存。

1.1.2 培养液

LB液体培养基(g/L)：各自称量氧化钠10g、发酵粉5g、蛋白胨10g，溶解1L双蒸水中，并根据加上2mol/LNaOH或HCl调整pH至7.0。

LB固态琼脂粉培养液：LB液体培养基中加上浓度值为20g/L的琼脂粉。

高渗液体培养基：LB液体培养基巾加上0.5mol/L山梨糖醇。

电钻培养液：LB液体培养基中分別加上0.5mol/L山梨糖醇和甘油果糖，浓度值为100g/L的葡萄糖水。

RM培养液：LB液体培养基中加上0.5mol/L山梨糖醇和0.38mol/L甘油果糖。

TB培养液(g/L)：各自称量发酵粉24g、蛋白胨12g、凡士林5g、三水磷酸氢二钾16.43g、磷酸二氢钾2.31g，溶解1L双蒸水中，并加上2mol/LNaOH或HCl调整pH至7.0。

1.1.3 实验试剂

pH至7.0。1.1.3实验试剂QuickcutHindⅢ约束性内切酶：购自TaKaRa生物技术技术性有限责任公司；2xphantaMaxMasterMix、ExnaseⅡ无缝连接检测试剂盒：购自诺唯赞(南京市)生物技术有限责任公司；DL-10000DNAMarker、氨苄青霉素、四环素：购白宝生物有限责任公司；质粒提取检测试剂盒、琼脂糖电泳DNA同收检测试剂盒：购白天根生化高新科技(北京市)有限责任公司

UnstainedProteinMWMarker标准蛋白质品、蛋白质胶制取检测试剂盒：购自碧云天生物技术性有限责任公司：分子结构级的蛋白胨和发酵粉：购自美国Oxiod企业：别的基本实验试剂：购自国药集团化学药品有限责任公司。

1.1.4 关键仪器设备

PCR仪：购自英国Bio-Rad公司：722型紫外线由此可见光度计：购白上海仪电分析仪有限责任公司：冷藏式离心脱水机：购自Beckmancoulter企业：KQ-250E型超音波体细胞破碎机：购自宁波新芝生物技术股权有限责任公司；pH计：购自法国Mettler-Toledo企业：高效率液相色谱：购自安捷伦科技有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计

以质粒pET-24a( )-gadB为模版，依据无缝拼接复制同宗臂设计原理各自设计方案正、反方向引物设计：正方向弓I物(F1)：57-GGAGTGTCAAGAATGGACCAGAAGCTGTTAACGGA-3'：反方向引物设计(R1)：5'-‘ITTATTACCAAGCTTTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTC-3’。

以质粒pHY300PLK为模版，依据无缝拼接复制同宗臂设计原理各自设计方案正、反方向引物设计：
正方向引物设计(F2)：5'-TCAAATAAGGAGTGTCAAGAATG-3’：反方向引物设计(R2)：5’-GGTGTTTTTTTACCAAGCTT-3’。
将制定好的引物设计送至苏州市金唯智生物技术公司生成。

1.2.2 目的基因和表达载体的获得

以试验室储存的质粒pET-24a( )-gadB为模版，F1/R1为正反面向引物设计增加gadB目的基因；PCR反映管理体系(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂034μL、dNTP4μL、模版DNA0.5μL，正、反方向引物设计各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR程序流程：94℃预转性5min，98℃转性10S，55℃淬火5S。72℃拓宽2min，转性至拓宽全过程开展29个循环系统：72℃拓宽10min；4℃储存。

以质粒pHY300PLK为模版，F2/R2为正反面向引物设计增加表达载体；PCR反映管理体系(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂O34μL、dNTP4μL、模版DNA0.5μL,正、反方向引物设计各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR程序流程：94℃预转性5min，98℃转性10s，55℃淬火5S，72℃拓宽6min，转性至拓宽全过程开展29个循环系统：72℃拓宽10min；4℃储存。

目的基因和表达载体PCR杂带根据琼脂糖核苷酸电泳原理开展认证。

1.2.3 目的基因和表达载体的联接与评定

1.2.2已认证准确的PCR物质根据琼脂糖疑胶同收检测试剂盒开展回收利用。回收利用后的PCR物质用ExnaseⅡ连接酶联接，其联接管理体系如下所示：ddH₂O5.3μL、5×CEBuffer2μL、ExnaseⅡ1μL、表达载体1.16μL、目的基因0.54μL，放置PCR仪37℃反映30min进行联接。

选用大肠埃希菌JMl09热击转化法后，将转换细胞液施胶至含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，在37℃恒温培养箱颠倒塑造10～12h，挑菌单菌体至含100μg/mL氨苄青霉素的10mLLB液体培养基中，放置振荡培养箱37℃、200r/min塑造8～10h后搜集菌体，并获取质粒便于认证和开展事后试验。将获取的质粒开展HindⅢ酶切认证准确后送到苏州市金唯智生物技术有限责任公司转录组测序。将转录组测序恰当的质粒根据触电转化法导进表述寄主B.Subtilis中，将转换细胞液施胶至含20μg/mL四环素的LB共体培养液上，在37℃恒温培养箱颠倒塑造10～12h，挑菌单菌体至含20μg/mL四环素的10mLLB液体培养基中，放置振荡培养箱37℃、200r/min塑造8～10h后搜集菌体，并获取质粒开展酶切认证。