1.3方式

1.3.1DNA获取

选用天根病菌基因DNA获取检测试剂盒获取病菌基因，具体做法和流程参考检测试剂盒使用说明。所获取的菌种DNA运用核苷酸蛋白质检测仪和Qubit荧光定量检测仪检验基因DNA的含量和浓度值，并送北京市诺禾致源科技发展有限责任公司开展全基因组测序。

1.3.2病菌全基因组测序及生物信息学剖析

经电泳原理检验达标的DNA试品用超音波粉碎仪任意切断成尺寸约为350bp的精彩片段，经尾端修补、加A尾、加转录组测序连接头、提纯、PCR扩增等流程进行百度文库制取。应用Qubit2.0和Agilent2100对搭建好的百度文库开展基本定量分析和插进精彩片段检验。插进精彩片段合乎期望后，应用Q-PCR对百度文库的合理浓度值开展精确定量分析。百度文库检验达标后选用北京市诺禾致源科技发展公司的IlluminaNovaSeq6000转录组测序系统软件开展全基因组测序。对illumina转录组测序服务平台的信息开展低品质过虑，包含除去失效数据信号、除去转录组测序连接头和锚定引物编码序列、除去繁杂编码序列和反复编码序列，进而得到优质的合理数据信息（CleanData）开展后期剖析。应用SOAPdenovo手机软件开展拼装，用RAST对拼装编码序列开展注解(http://rast.nmpdr.org)。应用基因临床流行病学核心（CenterforGenomicEpidemiology）CGE的默认设置阀值，对拼装编码序列开展评定（http://www.genomicepidemiology.org），运用ThePathosystemsResourceIntegrationCenter（PATRIC）对基因构成开展剖析（https://www.patricbrc.org/），运用CGEVirulenceFinder在线数据库对血清蛋白分析、MLST分析和感病遗传基因开展剖析。

1.3.3特征遗传基因PCR检验方式

将获取的CMCC44841基因DNA定量分析后，各自开展10倍梯度方向稀释液，获得10-1、10-2、10-3、10-4系列产品浓度值，参考GB4789.6-2016中引物设计编码序列和PCR检验方式 ，开展astA、aggR、pic特征遗传基因PCR扩增和敏感度检验，并且用1%琼脂糖电泳电泳原理检验PCR物质。

1.3.4国家标准物质的生产制造制取

1.3.4.1EAEC菌体国家标准物质的制取

取CMCC44841一代新鮮塑造物，画线注射于TSA平板电脑，36℃塑造24h。用无菌棉签从平板电脑上刮除菌体，添加到带有海藻糖和胎牛血清的干冻保护膜中，涡流搅拌，用移液器汲取20μL在较低温度下冷冻成小球，随后于冷冻式干燥机中低温干燥。将干冻后的菌球放置2mL的西林瓶中，运用冷冻式干燥机开展真空泵旋盖密封性。最后制取成EAEC成分为103CFU/试品的菌球。

1.3.4.2EAECgDNA国家标准物质的制取

将纯净度A260/A280为1.7的20µgDNA添加到20ml带有聚糖的干冻保护膜中，用移液器汲取20μL在较低温度下冷冻成小球，随后于冷冻式干燥机中开展低温干燥，最后制取成成分为20ng/试品的菌球。将干冻后的菌球放进2mL的西林瓶中，将橡胶塞子虚掩的盖在西林瓶上，随后用冷冻式干燥机开展真空泵旋盖。

1.3.5国家标准物质匀称性检测

1.3.5.1EAEC菌体国家标准物质匀称性检测

依据国家标准物质匀称性科学研究提取试品总数规定，从制作的一批600瓶国家标准物质中随机抽取20瓶试品，一瓶试品充足溶解1mL盐水，应用螺旋式施胶仪E50方式在TSA平板电脑上开展螺旋式施胶，每一个试品2个平行面。36℃塑造24h后对平板电脑开展菌落计数。依据CNAS-GL003对记数結果开展单因素方差分析，点评试品的匀称性。

1.3.5.2EAECgDNA国家标准物质匀称性检测

依据国家标准物质匀称性科学研究提取试品总数规定，从制作的一批300瓶国家标准物质中随机抽取10件试品，向一瓶国家标准物质试品添加100μLddH2O，充足融解，制取成20ng/100μL浓度值的DNA试品，取2μL做为模版，参考GB4789.6-2016中引物设计编码序列和PCR检验方式 ，开展astA、aggR、pic特征遗传基因PCR扩增。

1.3.6国家标准物质稳定性测试

1.3.6.1运送可靠性

将制作的EAEC菌体国家标准物质和gDNA国家标准物质各自储存于25℃和37℃标准下，EAEC菌体国家标准物质实验周期时间为7天，各自于1、3、5、7天提取3个试品，开展含菌量测量。依据CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ规则对结论开展可靠性点评。EAECgDNA国家标准物质实验周期时间为14天，各自于1、3、5、7、14天提取3个试品，对特征遗传基因开展PCR扩增，调查试品的运送可靠性。

1.3.6.2贮藏可靠性

将制作的EAEC菌体国家标准物质及gDNA国家标准物质各自于-20℃、4℃标准下储存两个月。于4℃储存7、14和28天，-20℃储存28和六十天，各自提取3个试品开展菌成分测量，于4℃和-20℃储存28、45和六十天各自提取3个试品开展特征基因检查，调查试品的贮藏可靠性。依据CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ规则对EAEC国家标准物质开展可靠性点评。

1.3.7国家标准物质的合作认证

应用以上制取好的试品，依照我国药品标准化学物质合作校准实施办法，发送给3家试验室，编码各自为A、B和C，各家试验室接到10件试品，参考合作认证安全操作规程对样本中EAEC国家标准物质以及gDNA国家标准物质开展检测，包含菌落计数和特征基因检查。

1.3.8国家标准物质应用实际效果认证

依据GB29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》，挑选肉制品、奶粉、豆腐乳、曲奇饼干和薯条5种食品类栽培基质共20份试品对EAEC国家标准物质的运用作用实现认证，试品信息内容见表1。先将EAEC103CFU浓度值的国家标准物质溶解1mL盐水中，每一件试品各称量2份，25g/份，一份一切正常检测，一份添加国家标准物质100μL，依据GB4789.6-2016开展实际操作。增菌后画线分离出来平板电脑观查是不是有典型性菌体生长发育，并开展PCR确定。