芽胞是病菌在自然环境威逼（如超低温、旱灾和营养成分欠缺等）下产生的休眠状态体。因其特有的构造特点而对高溫、髙压、干躁、辐射源、超低温、腐蚀成分等具备较强的抵抗性。如何把芽胞消灭一直是食品杀菌行业亟需攻克的至关重要的问题。目前消灭芽胞主要是靠传统式的高溫、髙压的方式 ，殊不知高溫、髙压在消灭芽胞的与此同时，也会造成营养食品外流，口味、口味等质量的明显降低。怎样在常温状态消灭芽胞一直是食品类行业科研工作人员的一大挑戰。研究发现，当芽胞出芽后，其抵抗性消退，这也为消灭芽胞给予了一个合理对策。现如今，先出芽后消灭是消灭芽胞的一个最重要途径。

肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，由N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNac）根据β-1，4糖苷键联接汇聚而成。与MurNac相接的先后是L-Ala，γ-Glu，m-Dpm和D-Ala。革兰氏阳性菌阴性菌和阳性菌的关键差异在第三个碳水化合物，大部分阳性菌的第三个碳水化合物是L-Lys。胞壁肽是肽聚糖酶解后物质。研究表明，带有Dpm的胞壁肽是一种合理的出芽剂，能推动芽胞出芽。最少的合理结构单元的胞壁肽为二糖三肽，其二聚体或三聚体仍然能诱发芽胞出芽。目前，中国都还没有关胞壁肽分离纯化的报导，都没有有关胞壁肽对芽胞出芽的危害科学研究。文中根据酶解等方式取得成功分离纯化了胞壁肽，科学研究胞壁肽针对芽胞出芽的危害，为后期科学研究打下基础。

1原材料与方式

1.1实验原材料

枯草枯草芽孢菌（Bacillus.subtilis168），购自我国的工业技术微生物菌种菌种保藏管理处（CICC）。

1.2实验实验试剂

LB液体培养基，北京索莱宝高新科技有限责任公司；BacterialAgar（BD）；α-胃蛋白酶、蛋白酶、变溶菌素，选购自英国Sigma企业；其他实验试剂均为分析纯。

1.3仪器设备及机器设备

颠倒光学显微镜，德国蔡司企业；高效率液相色谱仪，日本安捷伦仪器企业；超高效液相色谱-质谱分析液质仪，英国沃特世企业；电加热恒温培养箱，上海一恒高新科技有限责任公司；傅里叶变换红外光谱分析扫描机，英国珀金埃尔默企业；500兆磁共振谱仪，法国布鲁克企业；工作压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；多用途酶标仪，法国帝肯企业；匀质粉碎仪，英国Fastprep24；冷冻离心机，日本日立企业。

1.4实验方式

1.4.1枯草枯草芽孢菌芽胞的制取

菌苗首先用LB琼脂粉培养液活性3代之上，连接2×SG培养液中涂板塑造。在37℃塑造2d后，用相差显微镜镜检查芽胞，当视线中绝大多数芽胞从纤维细胞中掉下来后，用冷的无菌检测双蒸水将培养液上的芽胞清理搜集到离心管架中，离心式标准为8000g、4℃、10min，离心式多次。离心式历程中确保全过程在低溫标准中开展。离心式后去除上清液，得到的芽胞沉积重悬在ACES缓冲溶液（0.05mol/L，pH7.0）中，最终用相差显微镜镜检查，视线中≥95%的芽胞展现光亮状即可应用。芽胞浓度值约为1.0×10⁸CFU/mL，储放于4℃电冰箱，一个月内应用。

1.4.2芽胞平板电脑记数

将芽胞混液开展梯度方向稀释液，枯草枯草芽孢菌芽胞选用营养成分琼脂粉培养液开展竭尽平板电脑记数，每一个平板电脑中添加1mL稀释液菌液。枯草枯草芽孢菌芽胞在37℃标准下开展塑造，塑造24h。除菌实际效果用芽胞降低的多数表明：lg（Nt/N0），在其中，Nt为解决后生存的菌体数，N0为解决前菌落总数。

1.4.3芽胞出芽实验

汲取适当芽胞液于离心管架中，添加适量出芽剂。置放在摇床中塑造1h（37℃，200r/min）。以后将芽胞液放进80℃水浴中加温20min。平板电脑记数测算芽胞出芽率。

1.4.4肽聚糖的获取

选用枯草枯草芽孢菌（Bacillussubtilis168）的植物细胞获取肽聚糖。选购的菌苗在液体培养基中活性3代后应用。将枯草枯草芽孢菌注射到LB琼脂粉培养液上，于37℃塑造24h。取新鮮单菌体注射到适当的LB液体培养基中塑造至OD600约1.0，离心式搜集菌体（8000×g、4℃、10min），用冷的无菌检测双蒸水清理2次。将沉积再次飘浮于8%SDS水溶液中，烧开30min，离心式（13000×g，15min，25℃）搜集沉积，清理多次直到去除残存的SDS。SDS解决去除了菌体的其他蛋白，非共价键融合的蛋白和脂多糖。将沉积溶解无菌检测双蒸水中匀质粉碎仪粉碎病菌，不可溶植物细胞成分再根据离心式搜集（40000×g，30min，25℃）。搜集的不可溶植物细胞进一步用α-胃蛋白酶、蛋白酶开展酶解，以去除植物细胞上的糖元、共价键融合的蛋白。之上二步酶解均在缓冲溶液中开展（10mmol/LＴris-HCl，pH8.0），在蛋白酶中必须添加10mmol/LCaCl2。将酶解液添加SDS（终质量浓度1%）烧开钝化处理蛋白酶，并清理去除SDS。将植物细胞再次飘浮于盐酸（5mg细胞壁飘浮于2mL48%HF）中，4℃解决48h。HF能够去除肽聚糖上磷酸二酯键共价键联接的次生植物细胞含糖量，包含磷壁酸、poly-（β，1-6GlcNAc）等。植物细胞成分再各自选用8mol/LLiCl和0.1mol/LEDＴA清理，无菌水清理2次，最终选用甲苯去除脂磷壁酸和脂多糖。将试品干冻，获得肽聚糖。

1.4.5胞壁肽分离纯化

将获取的肽聚糖飘浮于12.5mmol/L聚磷酸盐缓冲溶液（1mmol/LMgCl2，pH6.0，0.02%叠氮化钠）中，添加5μg/mL变溶菌素，于37℃酶解24h。酶解的胞壁肽必须选用硼氢化钠复原，避免Cl的异构化。将胞壁肽飘浮于100mL0.5mol/L的硼酸盐缓冲溶液（pH9.0）中。胞壁肽复原选用新鮮配置的25mL，25mg/mLNaBH4，在添加全过程使得pH维持在9.0。氧化反应在室内温度中维持15min并不断地震荡，添加H3PO4使反映停止，将pH调为4。所得的试品储存在-20℃。复原的胞壁肽选用HPLC（Shimadzu）分离出来，ODS色谱柱（Hypersiloctadecylsilanecolumn，250mm×4.6mm，颗粒物：5μm，30105-254630，ＴhermoFisherScientific）。过柱液分别是：A，40mmol/L倍他米松（pH4.5）；B，40mmol/L倍他米松（pH4.0）并添加20%（摩尔分数）工业甲醇。A、B流动性看中添加0.00025%的叠氮化钠。离子交换柱均衡柱头选用流动性相A，柱温52℃，流动速度0.5mL/min，均衡1h。可溶胞壁肽气相100μL，气相5min后，过柱程序流程为B流动性相以线形梯度方向从0到100%，時间为5min到270min，流动性相流动速度维持在0.5mL/min。胞壁肽成分检验选用紫外线探测器，光波长为206nm

1.4.6胞壁肽成分除盐

胞壁肽成分干冻后再次飘浮于无菌检测超纯水系统中，选用HPLC法开展除盐，离子交换柱为上述情况分离出来柱。柱头选用0.007%（摩尔分数）三氟乙酸均衡，柱温35℃，流动速度1mL/min，胞壁肽选用50%工业甲醇（0.0025%三氟乙酸）线形梯度方向（0～100%）过柱，过柱時间在30～50min中间，胞壁肽成分检验选用紫外线探测器，光波长为206nm。

1.4.7三重四级杆串联质谱评定

除盐的胞壁肽成分选用三重四级杆串连质谱仪器（QuattroMicro，Micromass）开展评定。全逐行扫描（MSScan）质谱分析标准：共价键（ESI ）数据收集方式造成准分子离子峰[M H] ；m/z扫描仪范畴100～2000u；毛细血管工作电压3.5kＶ；锥孔工作电压40Ｖ；提纯工作电压5.0Ｖ；离子源溫度110℃；脱有机溶剂溫度450℃；脱有机溶剂气650L/h；锥孔反吹气检查50L/h；RF镜片工作电压0.5Ｖ。

1.4.8红外扫描光谱仪

选用压片糖果法将1.5mg干冻的GM-ＴriDAP与200mg干躁的KBr在玛瑙研钵中混和碾磨匀称，放置模具中，用粉末压片机完成压片糖果（工作压力为20～30MPa）1min，取出后获得全透明的试品片状，用傅里叶变换红外线谱仪开展红外光谱分析的扫描仪，扫描仪范畴4000～500cm^-1。

1.4.91HNMR

将2mg干冻的GM-ＴriDAP试品溶解1mLD2O中，低温干燥并反复3次将糖肽中的开朗H换置，溶解0.5mLD2O之后放置核磁管中，磁共振剖析选用500兆磁共振谱仪，室内温度20℃，500MHz作氢谱。

1.5数据分析与剖析

全部实验均反复3次。制图应用Origin8.5手机软件。